[发明专利]一种阿胶多肽及其制备方法

权利要求书

1.一种阿胶多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、ANKGFLEEVR中的一种。

2.如权利要求1所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）阿胶提取液的制备：阿胶研磨成粉，加去离子水，在一定温度下炖化，冷却后冷藏过夜，离心取炖化液上清，制得阿胶提取液；

（2）阿胶多肽的制备：步骤（1）的阿胶提取液经胰蛋白酶酶解，取酶解液上清，经C18固相萃取柱分离纯化，洗脱液干燥后再溶解过0.45 µm滤膜，得阿胶多肽；

（3）步骤（2）制备所得阿胶多肽以液相色谱-质谱联用进行检测；

（4）步骤（3）的检测结果进行数据分析,合成阿胶多肽氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）阿胶提取液的制备，具体为：阿胶研细成阿胶粉，加入20倍重量的去离子水，80℃炖化30 min，冷却后冷藏过夜，将炖化液于4℃以18000rpm离心5min，取上清液过滤后，得阿胶提取液。

4.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）阿胶多肽的制备，具体为：步骤（1）制备的阿胶提取液以10 % NaOH溶液调节pH =7.5，40℃水浴中以浓度为3×10⁴ U/g~6×10⁴ U/g胰蛋白酶酶解，酶解过程中每隔1 h调节一次pH，使pH值始终保持在7.5；酶解4 h后灭酶活，冷却后于4℃以18000rpm离心5min，取上清液3mL过C18固相萃取柱分离纯化，预先以3 mL甲醇、3 mL去离子水活化，以3×3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45℃氮吹干，以1 mL 1 %甲酸溶液溶解，过0.45 µm滤膜，得阿胶多肽。

5.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中阿胶多肽液相色谱-质谱联用进行检测，其液相色谱分离纯化的条件为：Hypersil GOLD UPLC C18色谱柱，100m × 2.1 mm，1.9 µm；柱温：30℃；流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，洗脱梯度：0~50 min，乙腈10%~90%；50~55 min，乙腈90%；55~56 min，乙腈90%~10%；56~60 min，乙腈10%；流速：0.3 mL/min；进样量：10 µL。

6.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）中阿胶多肽液相色谱-质谱联用进行检测，其质谱条件为：扫描模式：Full MS/dd-MS2，分析时长60 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：100-1500 m/z，一级质谱分辨率：70000 at m/z，AGGtarget: le6，一级Maximum IT: 100 ms，Number of scan ranges: 1，动态排除Dynamicexclusion: 40.0 s一次，MS2 Activation Type: HCD，Isolation window: 0.4 m/z，二级质谱分辨率：17500 at m/z 200，Microscans: 1，二级Maximum IT: 50 ms，碰撞能量: 30eV，Underfill ratio: 0.1%；电喷雾离子源ESI：载气为纯度99.5%的高纯氮气，鞘气流速40个arb单位，辅气流速15个arb单位；喷雾电压3.2 KV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛细管温度320℃，离子透镜电压频率S-lens RF level为60，辅气热源温度350℃。

7.根据权利要求2所述一种阿胶多肽的制备方法，其特征在于：步骤（4）数据分析具体为：采用MaxQuant进行数据分析；搜索针对包含来自Uniprot的阿胶的蛋白质序列数据库；蛋白FDR设置为0.01；最小氨基酸长度设置为3；可变修饰设为N-Acetyl和Oxidation；固定化修饰设置为Carbamidomethyl ；专一性酶设置为胰蛋白酶；最大裂解丢失设置为2，所有常见的污染物和相反的命中被删除。