[发明专利]斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用

说明书

本发明公开了一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用，属于生物技术领域。本发明包括PCR引物和探针设计、DNA模板制备、PCR扩增及通过荧光信号进行结果判断。本发明针对鮰疱疹病毒相应基因保守序列设计特异性的引物和taqMan探针，经过充分优化，独创引物探针、反应条件，从而建立一种快速可靠的荧光定量PCR检测斑点叉尾鮰疱疹病毒的方法。本发明实现了对DNA模板的定量，具有操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高和结果可靠等优点，能在斑点叉尾鮰疱疹病毒病早期快速诊断和实时监测方面发挥重要作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及淡水养殖动物病原的分子检测方法，具体涉及一种利用taqMan荧光定量方法建立的用于斑点叉尾鮰疱疹病毒病(CCVD)病原的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用。

背景技术

斑点叉尾鮰病毒(Channel Catfish Virus，CCV)是一种有囊膜的双链DNA病毒，又称鮰疱疹病毒I型(Ictalurid herpesvirus 1)，能够对斑点叉尾鮰鱼苗和鱼种造成致死性感染。随着斑点叉尾鮰养殖规模的不断扩大，集约化程度日益提高，养殖环境恶化，斑点叉尾鮰病害日趋严重，特别是由斑点叉尾鮰病毒(CCV)引起的斑点叉尾鮰疱疹病毒病(Channel Catfish Virus Disease，CCVD)危害最大，给斑点叉尾鮰养殖业造成严重的经济损失。目前，CCVD的传统检测方法主要是采用细胞培养技术进行CCVD的诊断，然后结合血清中和试验、荧光抗体技术、ELISA或PCR鉴定，以上方法虽然准确可靠，但因具有操作繁琐、细胞难于培养、检测周期长等缺点，不能满足快速确诊病原、及时控制疫情的实际工作需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用，本发明的检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠。

为解决上述技术问题，本发明提供一种斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测引物，包括一对靶基因引物和探针引物，其中，靶基因引物包括上游CCV-F序列和下游CCV-R序列，所述上游CCV-F序列如SEQ ID NO:1所示，下游CCV-R序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针引物CCV-Probe序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测试剂盒，包括上述的引物。

进一步地，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为斑点叉尾鮰CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒DNA；阴性对照为超纯水。

本发明还提供斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测方法，包括：

从待检斑点叉尾鮰组织中提取鮰疱疹病毒DNA；

以提取的鮰疱疹病毒DNA为模板，使用权利要1所述的引物组和权利要求2所述的探针，配制荧光定量PCR反应扩增体系，进行荧光定量PCR扩增反应；

通过实时荧光定量仪实时读取的荧光信号判断扩增结果，出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。

进一步地，所述荧光定量PCR反应扩增体系为：CCV-F终浓度为0.35μM，CCV-R终浓度为0.35μM，CCV-Probe终浓度为0.1μM，预混Mix 12.5μl，待检DNA 1～100ng，用超纯水补齐至25μl；设置阳性对照和阴性对照。

进一步地，所述阳性对照为含有斑点叉尾鮰CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒DNA，所述阴性对照为超纯水。

进一步地，所述阳性对照的制备方法为：提取鮰疱疹病毒DNA，利用权利要求1所述的引物对进行扩增，所得基因序列如SEQ ID NO:4所示，将该扩增片段连接到T载体中，获得的质粒即为阳性对照。