[发明专利]一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法

说明书

本发明提供一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，包括以下步骤：(1)蔗糖标准曲线的制作；(2)酶液的制备；(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的测定。本发明的方法能够准确的测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量。

技术领域

本发明涉及一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法。

背景技术

蔗糖是甜高粱茎秆糖分的主要存在形式，蔗糖在茎秆中的积累关系到甜高粱茎秆中的糖分含量和产量，而茎秆糖分积累过程与蔗糖代谢酶密不可分。植物蔗糖代谢包括蔗糖合成、运输和转化。蔗糖代谢由多种酶调控，与蔗糖代谢和积累密切相关的酶主要有蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SS)和转化酶(INV)。蔗糖合成的限速酶是果糖1，6- 二磷酸酯酶(FBPase)和磷酸蔗糖合成酶(SPS)。蔗糖降解由代谢关键酶转化酶、蔗糖合成酶等参与调节。

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase，E.C.2.4.1.13)是一种可溶性酶，分子量范围为280-540，由分子量约为83KD-100KD的亚基构成的四聚体。蔗糖合成最适pH值为8.0～9.5，蔗糖裂解最适pH值为5.5～6.5。蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase，E.C.2.4.1.14) 广泛存在于植物光和组织和非光和组织中，是一种可溶性酶，由分子量117KD-138KD的亚基构成，为二聚体或四聚体，是一种低丰度蛋白(不到可溶性蛋白的0.1％)，且不稳定。以不同发育时期的甜高粱和采后不同贮藏方式甜高粱茎秆为实验材料，旨在了解高粱茎秆的SS和SPS的含量变化，为甜高粱品质研究提供理论依据。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，包括以下步骤：

(1)蔗糖标准曲线的制作；

(2)酶液的制备；

(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的测定：

向试管中加入0.05M果糖溶液或F₆P溶液0.1mL，UDPG 0.1mL，0.1M Tris溶液0.1mL，0.05mL 10mM MgCl₂溶液，向空白试管中加入0.1mL 10％NaOH溶液，向所有待测样品试管中加入酶液0.2mL；将上述试管全部放入37℃水浴中保温30min；接着取出在沸水浴中加热1min，流水冷却；随后向样品试管中加0.1mL 10％NaOH溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着将上述试管全部加入3.5mL 36％HCL，85℃水浴加热10min，流水冷却；然后将上述试管全部加入0.5mL 0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；接着加入4.5mL蒸馏水，摇匀；最后在480nm下比色；结果按照以下公式计算：单位为：mg·g^-1·h^-1

其中：X：标准曲线上查得蔗糖含量(100μg/mL)

V1：样品总体积(mL)

V2：测定时取酶液体积(mL)

m：样品质量(g)

t：酶反应时间(h)。

作为优选，步骤(1)中，所述蔗糖标准曲线的制作方法为：准备一系列不同浓度的蔗糖溶液，然后加入NaOH溶液，沸水浴加热，并冷却；接着加入HCL溶液，80℃水浴加热，并冷却；随后加入间苯二酚溶液，65℃水浴加热，并冷却；最后在480nm下比色，以蔗糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制蔗糖标准曲线。