[发明专利]基于高阶G4和乙酰基抗体的电化学传感器制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用，具体步骤如下：金电极预处理，底物肽溶液涂覆Au电极。将底物肽修饰电极置于HAT p300反应混合物中孵育，滴加DNA探针‑乙酰化抗体混合液，加入TdT反应混合液使DNA延长生成随机排布的富G的DNA长链，利用钾离子使其形成N个随机G4结构，然后再加入大量DNAG链使其在镁离子的状态下叠加到随机G4结构上形成高阶G4。然后滴加hemin，使高阶G4具有辣根过氧化物酶活性，通过TMB+H₂O₂实现电化学信号输出，并用来检测乙酰转移酶活性及其抑制剂的筛选。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。

技术领域

本发明涉及一种组蛋白乙酰转移酶电化学传感器的制备及检测方法，尤其是涉及一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。

背景技术

组蛋白修饰是组蛋白蛋白的共价翻译后修饰，在表观遗传调控中至关重要。由于组蛋白改变，可以可控制地进行多种生物学事件，例如转录激活/失活，染色体包装和DNA损伤/修复。特别是赖氨酸残基的可逆乙酰化，是组蛋白修饰的主要机制之一。组蛋白赖氨酸乙酰化的水平由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的拮抗催化活性精确介导。通过乙酰化，HAT减少了组蛋白与其包裹DNA之间的静电相互作用，产生了一种开放的染色质结构，用于调节蛋白的可及性。相比之下，HDAC催化乙酰基的去除并增强组蛋白和基因的连接，从而导致封闭的染色体配置和转录抑制。HAT异常活动，诱导组蛋白乙酰化的干扰，已被证实与许多疾病的病因有关，包括癌症、神经障碍、慢性炎症和艾滋病感染。迄今为止，HAT已成为一类新的药物靶点，HAT靶向抑制剂也正在广泛研究中。为了满足HAT相关分析检测的需求，需要开发简便的HAT活性检测方法，这对于临床诊断的药物开发和药物研究具有重要意义，对于更好地理解表观遗传学相关研究也是必不可少的。

电化学技术因其优异的灵敏度和便于操作等优点而备受关注。如今，核酸纳米结构如DNA四聚体结构、类核酸结构，在翻译后修饰电化学传感领域中显示出显着的应用。最近，G-四链体(G4)的功能性核酸作为通用分子工具包引起了极大的兴趣。通常，G4 是独特的四链核酸结构，其通过堆叠Hoogsteen碱基配对的G-四联体形成，并且这种现象在富含G的序列中是普遍的。结合电化学具有操作简单、快速响应、低背景、高灵敏度和低仪器要求的优点，是目前用于生物传感的比较有前途的一种技术。

本发明提出了一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器的制备方法，首先将含巯基的底物多肽修饰至金电极表面，当乙酰化反应发生之后，乙酰辅酶A在乙酰转移酶的作用下将乙酰基转移到底物多肽的特定赖氨酸残基上，得到乙酰化的多肽，利用乙酰基和乙酰基抗体的特异性结合作用，将乙酰基抗体-DNA探针的复合物固化到电极表面，再利用TdT延长扩增作用使得DNA探针形成富G DNA长链，在钾离子存在时随机形成N个G-四联体，随后引入一条含有多个G碱基的DNA G 链，在镁离子存在下DNA G链会快速形成G-四联体，并有序堆叠到TdT延伸的G-四联体上，这些G-四联体结构通过与hemin的结合，可以形成具有类辣根过氧化物酶催化性能的DNA酶。过氧化氢(H₂O₂)在3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)存在下发生化学反应，产生明显的电化学响应。目前，国内外尚未发现基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器的制备方法及应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于高阶G4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用，具体步骤如下：