[发明专利]一种激光共聚焦显微镜的自动聚焦的方法

说明书

本发明属于激光共聚焦显微镜成像技术领域，一种激光共聚焦显微镜的自动聚焦的方法，利用数字CCD进行实时采集样品玻片表面（反射激光的面）的反射光，将采集到的图像转换成原始图片灰度值二维矩阵，利用压缩模块将原始图片灰度值二维矩阵压缩成压缩图片灰度值二维矩阵，压缩图片灰度值二维矩阵中图片灰度值最大的值即压缩聚光特征值a即为实际聚焦点位置；改变放有样品纳米台z轴的位置，得到不同位置所对应的a值，通过比较这些a值，其中最大的a值所对应的显微镜的位置就是激光的聚焦位置。

技术领域

本发明属于激光共聚焦显微镜成像技术领域，可用于荧光成像发生离焦后的自动聚焦。

背景技术

激光共聚焦荧光显微镜是一种通过激光激发样品、显微镜收集荧光和计算机图像处理技术获得实验样品三维成像信息。主要用于观察细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，进行实时测量以及定量分析等。

目前激光共聚焦显微镜在单分子光谱、微纳光学探测、生物医学成像等方面具有重要的应用，但是由于激光共聚焦显微镜受外界的扰动、环境温度变化以及自身的不稳定性的影响，

常常会出现聚焦焦点的离焦现象，从而会导致不能长时间稳定成像、成像模糊等问题。为了解决这些问题我们给出一种激光共聚焦显微镜自聚焦的方法和装置。

发明内容

本发明主要用于激光共聚焦显微镜，给出了一种激光共聚焦显微镜的自动聚焦的方法，最终实现了激光共聚焦显微镜在毫秒时间尺度内的自动聚焦并且可达到较高的空间聚焦精度。

本发明采用的技术方案是：一种激光共聚焦显微镜的自动聚焦的方法，按照如下的步骤进行：

步骤一、利用数字CCD进行实时采集样品玻片表面（反射激光的面）的反射光，将采集到的图像转换成原始图片灰度值二维矩阵，利用压缩模块将原始图片灰度值二维矩阵压缩成压缩图片灰度值二维矩阵，压缩图片灰度值二维矩阵中图片灰度值最大的值即压缩聚光特征值a即为实际聚焦点位置；

步骤二、改变放有样品纳米台z轴的位置，得到不同位置所对应的a值，通过比较这些a值，其中最大的a值所对应的显微镜的位置就是激光的聚焦位置。

作为一种优选方式：采用MATLAB程序压缩模块将采集到的图像转换成原始图片灰度值二维矩阵。

作为一种优选方式：将原始图片灰度值二维矩阵中横向和纵向每k*k个像素点对应的灰度值求和得到一个新的矩阵即压缩图片灰度值二维矩阵，实现图像的压缩，然后找出压缩后的压缩图片灰度值二维矩阵中图片灰度值最大的值即压缩聚光特征值a，其中k为压缩聚光长度，为自然数。比如把100×100像素的图像，把其中5×5个像素相加合并为一个像素，最后变为20×20像素的图像。

作为一种优选方式：由于激光的光斑和显微镜的不同，对于不同的显微镜镜我们需要首先选择不同的k值来达到更高的精度，通过已编写好的Matlab程序找出合适的k值。

作为一种优选方式：采用队列二值交替寻峰自动聚焦技术来更快的找到聚焦的位置，将压缩图片灰度值二维矩阵中的最大值及相应的纳米台z轴位置导入到LabVIEW程序中，分别记为a1和Num1；控制纳米台z轴向上移动0.1 μm，将采集到的图像中所对应的矩阵中的最大值和纳米台位置记为a2和Num2；比较这两个最大值的大小，向最大值较大的方向移动纳米台，并循环进行，直到得到所有压缩图像中最大值最大的图片所对应的纳米台位置，通过LabVIEW程序驱动纳米台至聚焦位置。

本专利采用的激光共聚焦显微镜的装置，由三个单元化模块整合而成，1、共焦显微镜主体，2、以数字CCD为核心的实时图像捕捉系统，3、以计算机为核心的仪器控制和分析系统。采用像素压缩聚光技术，能够准确地判断显微镜的离焦与聚焦状态。采用队列二值交替寻峰自聚焦算法，可在较短时间内实现自动聚焦，并且占用系统内存空间较小。将程序模块化，便于进行调试和优化。可移植性强，适用于多种实验系统实现自动聚焦。