[发明专利]超敏感荧光探针检验细菌中硝基还原酶及在细菌感染应用

说明书

本发明涉及一种基于Cy染料的硝基还原酶激活型Cy类荧光探针分子Ⅰ及该荧光探针与氨基糖苷类化合物相连得到的特异性靶向细菌的Cy‑氨基糖苷类荧光探针Ⅱ的制备方法及应用，属于生物荧光成像领域。上述两种探针分子均能特异性检验硝基还原酶，被硝基还原酶激活而荧光增强，降低了荧光成像的背景噪音、提高了成像信噪比。与已报道的硝基还原酶检测类探针分子相比，所合成Cy‑氨基糖苷类荧光探针分子具有良好的水溶性，极快的硝基还原酶反应速率，很低的硝基还原酶检测限。特别是，到目前为止，Cy‑氨基糖苷类荧光探针是首个报道的可以区分细菌感染和低氧肿瘤细胞或肿瘤组织的荧光探针分子。

技术领域：

本发明属于医药技术领域。涉及一种用于细菌感染检测并对肿瘤无影响的氨基糖苷类荧光探针，制备方法及应用。

背景内容：

医学成像，是可视化呈现人体内部结构，为临床诊断提供精准位置信息和形态学信息的技术。通过与正常的解剖生理结构比对，确认异常病变。^[1-4]与病理组织可视化的传统诊断成像相比，分子成像可以实现在早期的细胞和分子水平上诊断，在组织损伤发生或是在明显的疾病症状出现前观测到。^[5,6]临床诊断中主要应用的分子成像技术主要包括正电子衍射成像，单光子衍射，核磁共振和医学光学成像。在考虑到空间分辨率，时间分辨率，灵敏度和费用的情况下，每一种方法都有自身的优缺点。例如，正电子衍射成像利用放射性同位素作为示踪剂，可以获得高灵敏度，但是获取放射性核素需要用到昂贵的回旋加速器。单光子衍射，相对于正电子衍射成像费用明显降低，但空间分辨率降低而造成病灶定位困难。核磁共振具有高分辨率，低灵敏度的特点。而光学成像由于具有高灵敏度和特异性，而获得了广泛的关注。快速发展的光学成像显微镜和一系列易得的探针分子和标记物的出现，促进了在细胞，亚细胞和分子水平上对生理和病理的过程进行可视化监测。常用的探针分子和标记物包括有机分子，过渡金属复合物，镧系配合物，量子点，纳米颗粒和荧光蛋白等。

在光学成像中，光强度可以直观的反应探针的浓度和相应定位的信息。在多色成像中，不同探针的不同发射波长有不同的发光颜色。为了避免发光染料的光漂白，提高组织的穿透能力，需要增强发光染料的光稳定性，调节发射光进入近红外区域，以实现降低生物样品本身的光吸收，从而增强组织穿透能力。正常情况下，探针的荧光强度和样品的溶液浓度成比例，但是在复杂的生物体环境中，检测的准确性和精确性都会降低。这是因为荧光强度也会受到探针浓度在细胞或是生物体内的不确定性，激发光源的波动性和内源性荧光物质的荧光影响。例如，线粒体中的黄素和黄素蛋白能够在450-500nm激发，发射波长在500-600nm。脑组织中的脂质和蛋白的不同复合物，吸收波长在400-550nm，发射波长则覆盖了黄光区域并延伸到近红外区域。内源性荧光物质的吸收和发射波长覆盖了整个可见光区，导致探针的荧光信号收集受到干扰，产生波动性变化。^[7]

活体体内发光成像，作为光学成像的一种，包括生物发光成像和荧光成像。生物发光成像，是在存在荧光素酶底物或是由于lux操纵子存在而不需要荧光素酶底物的情况下，荧光素酶，或是通过基因工程而被荧光素酶标记的细菌，真菌，寄生虫和小鼠能够产生发光的现象，以及绿色荧光蛋白通过光照激活，直接产生发光的现象。所有的萤光素酶都是氧化酶，需要大量的氧气才能最佳地发挥作用；甲虫萤光素酶还需要细胞内三磷酸腺苷才能发挥作用；对于需要外源荧光素酶底物的系统，还必须考虑底物的药代动力学和生物体内分布。这些都限制了其进一步的应用。^[8]荧光成像可以实现对活细胞的特定细胞器和整个动物可视化成像，是一种强有力的生物研究工具，特别是具有荧光指导手术这一新兴领域的临床应用的价值。^[9]荧光成像具有高灵敏度，无损快速分析和实时监测的优点。由于小分子探针具有结构可修饰性，可实现对多种生物靶点的监测，实现在原始环境下对细胞内各种酶实时监测和成像。设计不同结构的探针分子，可以实现与酶相互作用时的光谱性质显著改变，进而提高分子探针的信噪比和灵敏度。^[9]