[发明专利]含miRNA mimic的人造脂质体及其制备方法与应用

权利要求书

1.含miRNA mimic的人造脂质体，其特征在于，所述人造脂质体的制备方法包括以下步骤：

1）通过恒压力控制挤出的方法制备脂质体

用250μL密封的玻璃注射器将50μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加15μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱108μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺21μL和11mg/mL胆固醇10μL依次加入上述玻璃瓶内；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入溶解有miRNA mimic的PBS缓冲液1ml，11mg/mL RNA酶抑制剂20μL；通过孔径50nm~800nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体；

其中1ml溶解有miRNA mimic的PBS缓冲液中含mimic 1：50 fmol；mimic 2：500 fmol；mimic 3：5 pmol，其序列信息如下：mimic-1：5′-GGGUACCAUACCGGUUGUCUUA-3′；mimic-2：5′-UGCUACUCCGAUCUUUAGCCUC-3′；mimic-3：5′-GUCCCACUCCGUAGAUCUGUUC-3′；

2）游离于脂质体外的miRNA mimic的去除

游离miRNA mimic的去除：将上述得到的脂质体转入孔径70nm的凝胶排阻层析柱进行排阻色谱分离，收集30-1000nm直径大小的组分。

2.权利要求1所述人造脂质体的以下任一应用：

（1）用于细胞外囊泡miRNA提取效率评估；

（2）用于细胞外囊泡miRNA定量分析；

所述应用为非诊断和治疗目的。

3.评价细胞外囊泡miRNA提取效率的方法，其特征在于，所述方法包括：将50-200μL细胞外囊泡提取样本与4-20μL已知浓度的权利要求1所述人造脂质体混合，用特定的方法进行囊泡的分离，然后提取囊泡中的RNA，通过PCR法检测miRNA mimic的表达量，即可得到细胞外囊泡提取样本的miRNA提取效率；

所述特定的方法为超速离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀或色谱法；和/或

提取囊泡RNA的方法为异丙醇沉淀法、乙醇沉淀法或吸附柱法。

4.非诊断和治疗目的的细胞外囊泡miRNA定量分析方法，其特征在于，所述方法包括：按照每1mL血浆样本加入4-20μL人造脂质体，或者每20mL尿液样本加入4-40μL人造脂质体，或者每2mL胸腹水样本加入4-40μL人造脂质体，或者每1mL唾液样本加入2-40μL人造脂质体，或者每2mL乳汁样本加入2-40μL人造脂质体的量，将待测样本与已知浓度的权利要求1所述人造脂质体混合，用特定的方法进行囊泡的分离，然后提取囊泡中的RNA，通过PCR法分别检测miRNA mimic及内源性目的miRNA的表达量，然后用得到目的miRNA的表达量比上miRNA mimic的表达量，即可得到待测样本中囊泡miRNA的相对表达量；

所述特定的方法为超速离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀或色谱法；和/或

提取囊泡RNA的方法为异丙醇沉淀法、乙醇沉淀法或吸附柱法。