[发明专利]一种检测四种肠道病毒的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.4种型别柯萨奇病毒核酸的检测引物和探针，其特征在于，包括4种型别基因的特异性扩增引物序列以及与该引物相应的特异性荧光探针序列，探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，各型别检测引物及探针序列下：

柯萨奇病毒A9型：

上游引物CVA9-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，

下游引物CVA9-R: 核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，

特异性探针CVA9-P: 核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，

柯萨奇病毒A10型：

上游引物CVA10-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，

下游引物CVA10-R: 核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，

特异性探针CVA10-P: 核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，

柯萨奇病毒B2型：

上游引物CVB2-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，

下游引物CVB2-R: 核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，

特异性探针CVB2-P: 核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，

柯萨奇病毒B5型：

上游引物CVB5-F：核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，

下游引物CVB5-R: 核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，

特异性探针CVB5-P: 核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

2.根据权利要求1所述的4种型别柯萨奇病毒核酸的检测引物和探针，其特征在于，所述柯萨奇病毒A9型检测探针、柯萨奇病毒A10型检测探针、柯萨奇病毒B2型检测探针、柯萨奇病毒B5型检测探针上带有的荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基- X - 罗丹明、6 - 羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3 .5、花菁5和花菁5 .5中的至少一种；所述柯萨奇病毒A9型检测探针、柯萨奇病毒A10型检测探针、柯萨奇病毒B2型检测探针、柯萨奇病毒B5型检测探针上带有的荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的4种型别柯萨奇病毒核酸的检测引物和探针，其特征在于，所述柯萨奇病毒A9型检测探针、柯萨奇病毒A10型检测探针、柯萨奇病毒B2型检测探针、柯萨奇病毒B5型检测探针上带有的荧光报告基团选自选自6-羧基荧光素、VIC荧光染料、磺酰罗丹明和磺酰罗丹明中的一种；所述荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂1或黑洞淬灭剂2中的一种；作为优选，柯萨奇病毒A9型检测探针的荧光报告基团为6-羧基荧光素, 荧光淬灭基团为BHQ1; 柯萨奇病毒A10型检测探针的荧光报告基团为VIC荧光染料,荧光淬灭基团为BHQ1; 柯萨奇病毒B2型检测探针的荧光报告基团为磺酰罗丹明, 荧光淬灭基团为BHQ2;柯萨奇病毒B5型检测探针的荧光报告基团为磺酰罗丹明,荧光淬灭基团为BHQ2。

4.一种同时检测4种型别柯萨奇病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的4种型别柯萨奇病毒的检测引物和探针，其中所述柯萨奇病毒A9型检测探针、柯萨奇病毒A10型检测探针、柯萨奇病毒B2型检测探针、柯萨奇病毒B5型检测探针上分别带有不同的荧光报告基团。

5.根据权利要求4所述的同时检测4种型别柯萨奇病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在使用时按以下比例配制引物、探针混合液：柯萨奇病毒A9型扩增引物对与柯萨奇病毒A9型检测探针的摩尔比为5:1，柯萨奇病毒A10型扩增引物对与柯萨奇病毒A10型检测探针的摩尔比为5:2，柯萨奇病毒B2型扩增引物对与柯萨奇病毒B2型检测探针的摩尔比为2:1，柯萨奇病毒B5型扩增引物对与柯萨奇病毒B5型检测探针的摩尔比为10:3，柯萨奇病毒A9型检测探针、柯萨奇病毒A10型检测探针、柯萨奇病毒B2型检测探针、柯萨奇病毒B5型检测探针的摩尔比为2:4:5:6。