[发明专利]一种合成D-柠檬烯的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种合成D-柠檬烯的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达HMG-CoA合成酶基因mvaS、乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE、牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因、D-柠檬烯合成酶基因ClLS、MVA激酶ERG12基因、MVAP激酶ERG8基因、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，宿主菌为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述HMG-CoA合成酶基因mvaS，GeneBank ID为AAG02439，来源于粪肠球菌E.facecalis；乙酰CoA乙酰基转移酶mvaE，GenBank NO.AAG02438，来源于粪肠球菌E.facecalis；牦牛儿基焦磷酸合成酶GPPS基因，Genbank No.AF513112.1，来源于巨冷衫Abies grandis；D-柠檬烯合成酶ClLS基因，Genbank No.AF514287.1，来源于柠檬Citrus limon；MVA激酶ERG12基因，GeneBank ID：855248，来源Saccharomyces cerevisiae；MVAP激酶ERG8基因，GeneBank ID：855260，来源Saccharomyces cerevisiae、甲羟戊酸脱羧酶ERG19基因，GeneBank ID：855779，来源Saccharomyces cerevisiae、异戊焦磷酸异构酶IDI基因，GeneBank ID：855986，来源Saccharomyces cerevisiae。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

4.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)构建包含mvaS、mvaE、GPPS、ClLS基因的重组质粒I和包含ERG12、ERG8、ERG19、IDI基因的重组质粒II；

2)将步骤1)构建的重组质粒I和重组质粒II转化入宿主菌，得到合成D-柠檬烯的基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒I构建所用的中间载体为pET28a(+)；所述重组质粒II构建所用的中间载体为pTrcHis2B。

6.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌在合成D-柠檬烯中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述合成D-柠檬烯是指将含有权利要求-3任意一项所述的基因工程菌的种子液接种至发酵培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6-1.0，然后加入诱导剂IPTG，以及正十二烷或邻苯二甲酸二异壬酯中的一种，继续发酵，将发酵液离心后，上清液过滤得到D-柠檬烯。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述种子液接种至发酵培养基中培养条件为：培养温度为30-37℃，搅拌速度为220rpm，pH6.0-8.0。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述IPTG在发酵液中的终浓度为0.2mmol/L；所述正十二烷或邻苯二甲酸二异壬酯在发酵液中的终浓度为5％-10％(质量体积比)。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述继续发酵的时间为60-72h。