[发明专利]一种重组磷脂酶D及其在合成磷脂酰丝氨酸或其它磷脂中的应用

说明书

本发明提供了一种重组磷脂酶D，是通过大肠杆菌表面展示技术高通量筛选技术和DNA基因重组技术筛选获得新型的PLD。本发明所提供的重组磷脂酶D，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明提供的重组酶PLDr34的转酯活力提高了3.24倍，转化率为80.3％，选择性为86.8％，是磷脂酰丝氨酸(PS)、DHA‑磷脂酰丝氨酸(DHA‑PS)及其它稀有磷脂合成的理想催化剂。

技术领域

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种重组磷脂酶D及其在合成磷脂酰丝氨酸、DHA-磷脂酰丝氨酸或其它磷脂中的应用。

背景技术

磷脂广泛存在于生物体组织结构中，是细胞膜的重要组成部分，由亲水性的磷酸基团头部和疏水性的脂肪酸链尾部构成。目前，已经确定了4个主要的基团：乙醇胺、肌醇、丝氨酸和胆碱。这些基团形成了最重要的磷脂，即磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰胆碱(PC)。PC是最主要的天然磷脂，然而并不能满足人类营养或者其它需求，从天然磷脂合成特定构型的磷脂具有重要的工业应用价值。

近年来研究表明，人体补充一定量的PS，有助于增强细胞膜的流动性，提高酶活，增强认知能力，延缓衰老。阿尔茨海默症(AD)是影响老年人生活质量的重要疾病之一，病因与大脑功能退化有关，改善受损的神经膜脂质组成，特别是增加神经细胞膜中PS的含量，是防治AD的有效方法之一。PS可以通过调节应激激素的含量，从而调节人体的活动，当体内应激激素含量降低时，PS可以刺激神经使其分泌激素；当应激激素含量升高时，可使机体产生抑制，缓解情绪紧张。另外，PS也能减少肌肉中氨基酸的流失，保护肌肉膜的功能。磷脂的脂肪酸侧链对于磷脂的活性也有重要影响，在过去的一段时间，磷虾油是人们能吃到的最具营养价值和健康的食品之一，在磷虾油中提取出的磷脂约占脂质的40％，Winther等人研究发现，58％的PC在至少一个位置含有n-3PUFAs，而10％的PC在两个位置含有n-3PUFAs，含量最高的n-3PUFAs是EPA和DHA，同时含有少量的十八碳四烯酸和二十二碳五烯酸(DPA)。DHA-磷脂酰丝氨酸(DHA-PS)和DHA-磷脂酰乙醇胺(DHA-PE)比DHA-磷脂酰胆碱(DHA-PC)运输DHA至大脑的效率更高。

后来研究发现，PS与PC以及PE等具有相似的结构，可以互相转化，因此酶法制备功能性磷脂的研究陆续开展。由于酶催化法在温和的条件下具有很高的选择性和良好的性能，因此生物催化合成功能性磷脂的方法很有意义，也更易获得化学催化不易得到的产物。

酶催化磷脂改性的反应主要有水解反应，酯交换反应，转磷脂酰反应等。磷脂酶D(PLD)能催化磷脂酰基与其它羟基化合物发生碱基交换反应，制备新型磷脂，酶法改性后的磷脂在营养价值、乳化性能、味道和色泽方面均得到改善和提高，从而大大拓宽磷脂的应用范围和价值。

尽管PLD展现出良好的催化潜能，但是作为一种细胞毒性蛋白，较低的产率限制了它们的工业化应用前景。包涵体的形成是限制PLD工业化应用的另一个因素，包涵体蛋白若想形成正确折叠的可溶性蛋白，一般需要加入化学试剂如尿素和氯化胍等来进行复性，通常需要过夜孵育和摇动/搅拌，有的甚至还需要微波加热作为辅助手段，这对PLD的生产或者应用是极为不利的。筛选高活力的PLD仍然是磷脂酶法改性的关键。

发明内容

本发明提供了一种重组磷脂酶D，是通过大肠杆菌表面展示技术高通量筛选技术和DNA基因重组技术筛选获得新型的PLD，并用该酶催化转酯反应来制备PS；从而克服了现有PLD酶活力低，表达水平不高的缺陷。

本发明所提供的重组磷脂酶D，包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)与1)中的序列具有90％以上同源性，由1)所衍生的酶；

优选的，所述的2)中的酶的同源性为95％以上；

更优选的，同源性为99％以上；