[发明专利]OPTN突变导致OPTN泛素化降解异常在神经元损伤中的作用及其验证方法

权利要求书

1.一种OPTN突变导致OPTN泛素化降解异常在神经元损伤中的作用，其特征在于，包括：

a、Hrd1 介导OPTN 的泛素化降解在神经元中的作用；

b、OPTN 突变对体内蛋白泛素化降解异常在神经元中的作用；

c、OPTN 突变对自噬的影响在神经元中的作用。

2.一种OPTN突变导致OPTN泛素化降解异常在神经元损伤中的作用的验证方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）过表达WT及E478G突变的OPTN 对神经元功能的影响

（1-1）神经元被感染WT、E478G 及泛素修饰位点与E478G 双突变病毒质粒，利用MTT 法检测存活情况、Tunnel 法检测细胞的凋亡、LDH 法检测细胞坏死情况、通过JC-10 染料测定细胞线粒体膜电位、通过Tom20 标记检测线粒体的变化；

（1-2）在上述神经元中，直接添加UPS 抑制剂MG132，利用MTT法检测存活情况、Tunnel法检测细胞的凋亡、LDH法检测细胞坏死情况、通过JC-10 染料测定细胞线粒体膜电位改变、通过Tom20标记检测线粒体的变化，同时利用SOD1、TDP-43及p62的抗体进行免疫共沉淀，检测SOD1、TDP-43及p62的泛素化影响；

（1-3）分别运用Western blot法检测细胞LC3B-I/II、ATG-5、p62和Beclin1 的表达水平，并通过荧光显微镜检测LC3B-GFP puncta的水平；运用Co-IP或者激光共聚焦显微镜检测p62-TBK1-OPTN的耦联情况，用电镜检测自噬小体的含量；

（1-4）同时在上述神经元中，分别加入外源性添加自噬不同阶段抑制剂，siRNA敲减自噬活化关键蛋白ATG5或者Beclin-1 抑制自噬后，再次利用MTT法检测存活情况、Tunnel法检测细胞的凋亡、LDH法检测细胞坏死情况、通过JC-10染料测定细胞线粒体膜电位改变、通过Tom20 标记检测线粒体的变化；

（1-5）综合分析上述结果，明确过表达WT及E478G突变的OPTN对神经元功能的影响；

（2）Hrd1 介导OPTN 的泛素化降解在神经元中的作用

（2-1）将Hrd1 的过表达载体或干扰表达慢病毒、WT、E478G突变、泛素化修饰与E478G共突变的OPTN慢病毒及不同的Ub感染神经元，直接添加UPS 抑制剂MG132，利用MTT法检测存活情况、Tunnel法检测细胞的凋亡、LDH法检测细胞坏死情况、通过JC-10染料测定细胞线粒体膜电位改变、通过Tom20 标记检测线粒体的变化，同时利用SOD1、TDP-43及p62的抗体进行免疫共沉淀，检测SOD1、TDP-43及p62的泛素化影响；

（2-2）分别运用Western blot法检测细胞LC3B-I/II、ATG-5、p62 和Beclin1 的表达水平，并通过荧光显微镜检测LC3B-GFP puncta的水平；运用Co-IP或者激光共聚焦显微镜检测p62-TBK1-OPTN的耦联情况，用电镜检测自噬小体的含量；

（2-3）同时在上述神经元中，分别加入外源性添加自噬不同阶段抑制剂，siRNA敲减自噬活化关键蛋白ATG5或者Beclin-1抑制自噬后，再次利用MTT法检测存活情况、Tunnel法检测细胞的凋亡、LDH法检测细胞坏死情况、通过JC-10染料测定细胞线粒体膜电位改变、通过Tom20 标记检测线粒体的变化；

（2-4）综合分析上述结果，明确干预Hrd1调节OPTN泛素化降解对神经元影响。

3.根据权利要求2所述的验证方法，其特征在于，步骤（1-4）和步骤（2-3）中的抑制剂选用3-MA、氯喹、氯化铵。

4.根据权利要求2所述的验证方法，其特征在于，步骤（2-1）中免疫共沉淀的具体步骤如下：

第一步、细胞转染质粒：293细胞内分别共表达（1）FLAG-Hrd1和Ub；（2）FLAG-Hrd1和Ub以及GFP-WT-OPTN ；（3）GFP-WT-OPTN和Ub ；

第二步、准备Protein-G Agarose和抗体的偶联；

1）孵育抗体和protein-G Agarose体系如下：500μl PBS+ 4μl anti-body GFP+8μl 5%BSA+40μl 50%protein-G Agarose 匀浆，冰上摇床孵育4h后4℃过夜；

2）4℃，12000rpm离心3-5sec，小心弃去上清；

3）加入500μl 细胞裂解液WI，上下颠倒数次，4℃，12000rpm离心5sec，小心弃去上清；

4）重复上述步骤一次，4℃备用；

第三步、裂解细胞

1）吸弃培养皿中的培养基，PBS清洗2次，加入适量的0.05%胰蛋白酶消化5 min；

2）加入完全培养基中和胰蛋白酶，轻轻吹下细胞，转移至灭菌离心管中；

3）1000rpm离心5min，小心弃去液体；

4）加入500μl 细胞裂解液，移液枪用力吹打细胞，冰上静置10min充分裂解，然后冰浴超声破碎10次，即为全细胞裂解液；

5）4℃，12000rpm离心45min，取上清，此为细胞蛋白上清，取50μl细胞蛋白上清，等比例加入50μl 2×SDS-PAGE Sample Buffer 95-100℃煮5min，即为Input样品，-20℃保存；

第四步、免疫共沉淀

1）取余下细胞蛋白上清，加入到偶联有抗体的Protein-G Agarose中，4℃摇床孵育6h或过夜；

2）4℃，12000rpm离心5sec，吸弃上清，加入500μl细胞裂解液，4℃摇床孵育10min，4℃，12000rpm离心5sec，吸弃上清；

3）重复上述步骤2次；

4）加入500μl WII，4℃摇床孵育10min，4℃，12000rpm离心5sec，吸弃上清；

5）重复上述步骤1次；

6）加入500μl WIII，4℃摇床孵育10min，4℃，12000rpm离心5sec，吸弃上清；

7）加入50μl 2×SDS-PAGE Sample Buffer，95-100℃煮5min，3000rpm离心5sec，转移液体至新的离心管，弃Protein-G Agarose，即为IP样品 ；

8）SDS-PAGE电泳分离Input和IP样品的蛋白，Western blot检测蛋白结合。