[发明专利]一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用

说明书

本发明公开了一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用。本发明通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高；再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，胞内NADPH供应和木糖醇产量进一步提高；最后敲除EMP路径关键酶基因pgi，胞内NADPH供应和木糖醇产量显著提高。构建的大肠杆菌基因工程菌2bzwfgndΔpgi相比出发菌株IS5‑5大幅提高木糖醇浓度、生产效率以及木糖醇对葡萄糖的产率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用。

背景技术

木糖醇作为一种天然存在的五碳糖醇，是一种白色的粉末状晶体，存在于许多植物和微生物体内，同时在人体的正常代谢中间产物中，也有木糖醇的存在。木糖醇在食品、医药、化妆品和保健品中都有广泛的应用。目前利用枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母以及大肠杆菌作为宿主生产木糖醇均有报道。木糖醇的生物技术生产是增加木质纤维素价值的有吸引力的途径，然而，辅因子供应通常限制了木糖醇生物合成的商业化。

申请人在公开号为CN105671013A的发明专利申请中公开了一种木糖还原酶突变体和基因工程菌，该木糖还原酶突变体来源为粗糙脉孢菌的木糖还原酶的8个氨基酸分别进行突变，8个氨基酸分别突变为：L102V，L107M，L109Q，I110C，V114I，KSN271-273RTT，获得的木糖还原酶突变体命名为XR-8M，经过突变后所得的木糖还原酶突变体降低了催化阿拉伯糖为阿拉伯糖醇的活性，提高了其转化木糖醇的选择性。

申请人在公开号为CN104789586A的发明专利申请中公开了：将插入序列IS5与R6K复制子、氯霉素抗性基因连接，然后与启动子P43、XR和终止子连接构建获得重组质粒pRC43。提取质粒pRC43，以HK401菌株为多拷贝整合宿主进行转化，获得的菌株再制备成感受态，导入PCP20质粒，借助FRT位点将菌体携带的氯霉素抗性基因删除，如此往复获得不同拷贝数的菌株IS5-1，IS5-2，IS5-3，IS5-4，IS5-5，IS5-6，经验证当拷贝数达到5个时，菌株生产木糖的能力较优。

然而，限于辅酶NADPH的供应，IS5-5菌株生产木糖醇速率还不够高，木糖醇浓度和木糖醇对葡萄糖得率仍有待进一步提高。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种基因工程菌及其在生产木糖醇中的应用。

一种基因工程菌，在大肠杆菌中过表达葡萄糖脱氢酶。过表达的方式优选为，由大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢酶基因得到。所述葡萄糖脱氢酶基因为zwf基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高。

所述的基因工程菌，在过表达葡萄糖脱氢酶的基础上，进一步在大肠杆菌中过表达葡萄糖酸脱氢酶。过表达的方式优选为，在大肠杆菌染色体中再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因。所述葡萄糖酸脱氢酶基因为gnd基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高；再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，胞内NADPH供应和木糖醇产量进一步提高

所述的基因工程菌，在过表达葡萄糖脱氢酶和葡萄糖酸脱氢酶的基础上，进一步在大肠杆菌中基因沉默或基因敲除磷酸葡萄糖异构酶基因。所述磷酸葡萄糖异构酶基因为pgi基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。通过在大肠杆菌染色体中插入一拷贝的葡萄糖脱氢基因zwf，胞内NADPH供应和木糖醇产量有所提高；再插入一拷贝的葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，胞内NADPH供应和木糖醇产量进一步提高；最后敲除EMP路径关键酶基因pgi，胞内NADPH供应和木糖醇产量显著提高。

优选的，上述基因的出发菌株为IS5-5。菌株IS5-5详见公开号为CN104789586A的发明专利申请。