[发明专利]一种水稻叶鞘原生质体高效转化基因模块和线路的方法

说明书

本发明公开了一种水稻叶鞘原生质体高效转化基因模块和线路的方法。本发明公开了水稻叶鞘原生质体的转化方法，包括：在水稻叶鞘原生质体中添加MMg溶液，得到水稻叶鞘原生质体悬浮液；在水稻叶鞘原生质体悬浮液添加质粒和质量百分比为40％的聚乙二醇‑钙溶液，混匀，静置；加入W5溶液混匀，离心，弃上清，W5溶液重悬沉淀，离心，弃上清，加入羧苄青霉素混匀，培养，完成原生质体的转化。本发明水稻叶鞘原生质体转化方法对PEG溶液配制、质粒浓度及转化时间等进行调整，将转化效率提高到80％，可使智能改造元器件在80％植物细胞中发挥功能，对初期元器件功能研究提供了可用数据，为后期作物智能改造元器件作用研究提供了便利。

技术领域

本发明涉及植物细胞生物技术领域，具体涉及一种水稻叶鞘原生质体高效转化基因模块和线路的方法。

背景技术

原生质体是指植物细胞在酶解或机械作用下发生质壁分离，获得的去除了细胞壁的裸露细胞。由于失去了细胞壁的阻碍作用，对DNA、病毒颗粒、细胞器、染色体等外源遗传物质更易摄取。在适宜的条件下，原生质体具有再生成完整植株的能力，是转化受体的理想材料，不仅大大缩减了实验周期，而且有助于得到体内实验的实时检测数据。PEG介导的植物原生质体瞬时转化在现代细胞生物学及分子生物学中发挥了巨大作用，被广泛应用于双分子荧光互补、亚细胞定位、转录因子活性检测和基因编辑等方面的研究。但不同植物物种间瞬时转化效率有较大差异。

目前已在模式植物拟南芥中建立了成熟高效的瞬时转化体系，并成功应用于功能基因组学研究。相比于双子叶植物拟南芥，单子叶植物水稻因其结构特殊，原生质体的制备会更加繁琐，尽管对水稻原生质体瞬时表达系统的应用已经有少量报道，但原生质体游离转化效率限制了该技术的应用，得率很低，并且缺少高效转化基因、基因模块、基因线路等载体的方法，因而尚未在水稻基因功能研究中获得广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题为如何提高水稻原生质体的转化效率。

为解决上述问题，本发明提供了一种水稻叶鞘原生质体的转化方法。

本发明水稻叶鞘原生质体的转化方法，包括如下步骤：

A1)在水稻叶鞘原生质体中添加MMg溶液，混匀，得到水稻叶鞘原生质体悬浮液；

A2)在水稻叶鞘原生质体悬浮液中添加载体和质量百分比为40％的聚乙二醇-钙(PEG)溶液，混匀，静置；其中，每100μL水稻叶鞘原生质体悬浮液加入大于等于100μg的载体和110μL聚乙二醇-钙溶液，所述每100μL水稻叶鞘原生质体悬浮液包含水稻叶鞘原生质体8×10⁴～2×10⁵个；

A3)加入W5溶液混匀，离心，弃上清，W5溶液重悬沉淀，离心，弃上清，加入羧苄青霉素混匀，培养，完成水稻叶鞘原生质体的转化。

上述转化方法中，所述聚乙二醇-钙溶液(PEG)的pH为7.5-8.0。

上述聚乙二醇-钙溶液的配置方法可包括如下步骤：

B1)将4g Sigma PEG3350(sigma-Fluka，#81240)溶于3mL水中，得到溶液A；

B2)1.093g甘露醇加入到2mL水中，再加入1mL 1M CaCl₂溶液(如不溶解的话，可以放到65℃助溶)，得到溶液B。

B3)将溶液A和溶液B混匀后，用KOH调pH到7.5-8.0(1uL KOH慢慢的加，pH稳定较慢)，最后定容到10mL。

上述转化方法中，所述静置可为28℃避光静置15-25min。

上述转化方法中，所述培养可为28℃避光孵育10-16小时。