[发明专利]一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒

权利要求书

1.一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括3对引物，分别为CHUV_F和CHUV_R、BCV_F和BCV_R、DAV_F和DAV_R；

CHUV_F：ggagagggtcatccactcaa；

CHUV_R：tcccatcaaacgttccatatgt；

BCV_F：gtacatgattttccgcaactatc；

BCV_R：tcctctattttgatccgaaacata；

DAV_F：ggaggagtgtcgaagagcac；

DAV_R：gtgctgccactctgtytcat；

还包括与引物配合使用的探针，具体为：与CHUV_F和CHUV_R引物配合使用的探针CHUV_Probe；与BCV_F和BCV_R引物配合使用的探针BCV_Probe；与DAV_F和DAV_R引物配合使用的探针DAV_Probe；

CHUV_Probe：FAM-tgccccgcaacacctcttctactct-BHQ1；

BCV_Probe：FAM-ctcttcggcttattccattcytcatctc-BHQ1；

DAV_Probe：FAM-tagytgaatataaacgtgcgggycg-BHQ1。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂；

所述的阴性对照模板为RNase-free水；

所述的阳性对照模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV灭活病毒；

所述的标准品模板有三个，分别为CHUV、BCV、DAV 基因节段2单链RNA。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，阳性对照模板中CHUV、BCV、DAV灭活病毒的拷贝数分别为2.6×10⁷拷贝/mL、3.1×10⁷拷贝/mL和1.9×10⁷拷贝/mL；标准品模板中CHUV、BCV、DAV的Seg-2 ssRNA的拷贝数分别为2.07×10¹⁴拷贝/mL、2.52×10¹⁴拷贝/mL和3.03×10¹⁴拷贝/mL。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂包括One StepPrimeScript RT-PCR试剂和ROX参比染料。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其扩增体系为：

2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ，10.0 μL；

TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL），0.4 μL；

PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ，0.4 μL；

ROX Reference Dye Ⅱ（50×），0.4 μL；

上游引物（10 μmol/L），0.4 μL；

下游引物（10 μmol/L），0.4 μL；

探针（10 μmol/L），0.8 μL；

模板，1.0 μL；

RNase-free水，6.2 μL；

总计20.0 μL；

所述的上游引物和下游引物所组成的引物对为CHUV_F和CHUV_R、BCV_F和BCV_R、DAV_F和DAV_R三对引物中的任意一种；所述的探针为所采用的上游引物和下游引物组成的引物对所配合使用的探针。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的扩增程序：

反转录42 ℃，5 min，共1个循环；预变性95 ℃，10 s，共1个循环；变性95 ℃，5s，退火60 ℃，34s，共40个循环。