[发明专利]一种迟缓爱德华氏菌快速检测方法

说明书

本发明提供了一种迟缓爱德华氏菌快速检测方法，属于病害微生物检测技术领域。它解决了现有检测迟缓爱德华氏菌费力、费时和低灵敏度等问题，一种迟缓爱德华氏菌快速检测方法，包括如下步骤：S01：提取待检测菌的基因组DNA；S02：将正向引物、反向引物、RPA探针、缓冲液和步骤S01中的基因组DNA混匀后，加入冻干酶粉，振荡混匀后离心，将上清液转移到反应管中，加入启动剂进行恒等温扩增反应，得到扩增产物；S03：将扩增产物稀释后滴加到LFD检测试纸条上的加样区，若出现阳性反应，则存在迟缓爱德华氏菌。本发明检测时间短等优点。

技术领域

本发明属于病害微生物检测技术领域，特别涉及一种迟缓爱德华氏菌快速检测方法。

背景技术

由迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)引起的爱德华菌病是水产养殖业最为重要的传染性疾病之一，给水产养殖业造成巨大的经济损失。能感染包括鳗鲡(Anguillajaponica)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、罗非鱼(Tilapia mossambica)、大黄鱼(Larimichthys crocea)等多种鱼类。它也能使人患病，属于一种人、鱼共患病原菌，对人类健康造成巨大威胁。然而传统的迟缓爱德华氏菌检测方法，例如选择性培养基和生理生化试验检测，尽管也能检测出病原体，但是费力、费时和低灵敏度等缺点使得其不能满足病害防治的要求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种迟缓爱德华氏菌快速检测方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种迟缓爱德华氏菌快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01：提取待检测菌的基因组DNA；

S02：将正向引物、反向引物、RPA探针、缓冲液和步骤S01中的基因组DNA混匀后，加入冻干酶粉，振荡混匀后离心，将预混液转移到反应管中，加入启动剂进行恒等温扩增反应，得到扩增产物；

S03：将扩增产物稀释后滴加到LFD检测试纸条上的加样区，若检测线上出现颜色，则存在迟缓爱德华氏菌。

正向引物和反向引物均用于扩增迟缓爱德华氏菌目的基因。

优选地，所述的正向引物，其核苷酸序列如下：

SEQ ID NO:1，5′-CCTTTAGCAACGTGGTCGAGTTCCAGTATGA-3′(32bp)。

优选地，所述的反向引物，其核苷酸序列如下：

SEQ ID NO:2，5′-CGTTCGGATGGATCGGCGTCTTATTCTTGTTA-3′(32bp)。

优选地，所述的反向引物的5′端用生物素(Biotin)标记。

优选地，所述的RPA探针，其核苷酸序列如下：

SEQ ID NO:3，

5′-CCAAACGCCTGCGCGAGCTGTCGTTCCTTAAC/idSp/CTGGGGTTTC CATTCGC-3′。

优选地，所述的RPA探针的上游5′端用FAM标记，下游3′端进行C3Spacer修饰。

优选地，步骤S02中，所述的恒等温扩增反应，其反应条件如下：恒等温40℃温度条件下，孵育4min，拿出反应管上下颠倒8-10次，低速离心3-5s,继续孵育16min,共反应20min。

优选地，所述的启动剂为醋酸镁(MgAc)。