[发明专利]递送外源RNP的慢病毒载体及其制备方法有效
| 申请号： | 201910979334.0 | 申请日： | 2019-10-15 |
| 公开（公告）号： | CN110684804B | 公开（公告）日： | 2023-04-18 |
| 发明（设计）人： | 蔡宇伽;凌思凯 | 申请（专利权）人： | 上海本导基因技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867 |
| 代理公司： | 上海段和段律师事务所 31334 | 代理人： | 郭国中 |
| 地址： | 201100 上海市闵行区都会路16*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 递送 rnp 病毒 载体 及其 制备 方法 | ||
1.一种递送外源RNP的慢病毒载体，所述慢病毒载体是通过将含有慢病毒载体基因组序列的质粒转染入病毒生产细胞，制备而得；其特征在于，所述慢病毒载体基因组序列分别位于表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达形成RNP所需蛋白质的质粒和表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒上；
所述表达膜蛋白的质粒包括表达VSV-G膜蛋白的质粒；
所述表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒是将RNA结合蛋白整合至第三代慢病毒GagPol长链蛋白的N-端；所述表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒序列为 SEQ ID NO.5所示；
所述表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒序列为 SEQ ID NO.2所示；
所述表达形成RNP所需蛋白质的质粒为表达含外源蛋白质SpCas9的质粒，其质粒序列为 SEQ ID NO.8所示；
所述表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒是通过将RNA结合蛋白所识别的RNA序列与目的RNA序列融合而得到；所述质粒序列为 SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的递送外源RNP的慢病毒载体，其特征在于，所述病毒生产细胞包括293T、293FT、HEK293。
3.一种根据权利要求1所述的递送外源RNP的慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将表达膜蛋白的质粒、表达含RNA结合蛋白的慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达慢病毒GagPol长链蛋白的质粒、表达形成RNP所需蛋白质的质粒和表达含RNA结合蛋白所识别的RNA茎环结构的外源目的RNA的质粒共转染病毒生产细胞；
S2、收集含病毒颗粒的上清，通过高速离心或者HPLC进行浓缩，得到含目的RNP的慢病毒颗粒。
4.一种根据权利要求1所述的递送外源RNP的慢病毒载体在制备递送Cas9或Cas9衍生物与gRNA形成的RNP用于实现基因编辑或者碱基编辑的产品中的用途。
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