[发明专利]一种GIV.1型诺如病毒的RT-LAMP法检测用成套引物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种GIV.1型诺如病毒的RT-LAMP法检测用成套引物，其特征是，所述成套引物包括外引物对GIV-F3和GIV-B3，内引物对GIV-FIP和GIV-BIP，以及环引物对GIV-LF和GIV-LB；GIV-F3的序列如SEQ ID NO:1所示，GIV-B3的序列如SEQ ID NO:2所示，GIV-FIP的序列如SEQ ID NO:3所示，GIV-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示，GIV-LF的序列如SEQ ID NO:5所示；GIV-LB的序列如SEQ ID NO:6所示。

2.一种GIV.1型诺如病毒的RT-LAMP法检测用试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括引物混合液，所述引物混合液含有权利要求1所述的成套引物。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征是，所述外引物对GIV-F3和GIV-B3、内引物对GIV-FIP和GIV-BIP、及环引物对GIV-LF和GIV-LB的摩尔比为1:8:(2-4)。

4.根据权利要求2所述试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括酶液，2×反应液，显色液及超纯水。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述酶液由浓度为6-10U/μl的BstDNA聚合酶，浓度为8-16U/μl AMV逆转录酶、以及水构成；

所述2×反应液由40mmol/L pH8.8的Tris-HCl，20mmol/L的KCl，20mmol/L的(NH₄)₂SO₄，质量浓度为0.2％的Triton X-100，由浓度均为2.8mmol/L的dATP、dTTP、dCTP、dGTP组成的dNTPs，1.6mmol/L的甜菜碱C₅H₁₁NO₂，16mmol/L的MgSO₄，以及水构成；

所述显色液为浓度4mmol/L的金属离子指示剂HNB储存液。

6.根据权利要求2所述试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括GIV.1型诺如病毒阳性对照品，浓度为20-100mg/L。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征是，所述GIV.1型诺如病毒阳性对照品浓度为50mg/L，且由以下方法获得：构建含有GIV.1型诺如病毒RdRp基因的质粒，进行体外转录反应获得RdRp基因的RNA片段，纯化后即得到GIV.1型诺如病毒阳性对照品；所述RdRp基因的序列如SEQ ID NO:7所示。

8.一种非诊断目的的GIV.1型诺如病毒RT-LAMP检测方法，其特征是，采用权利要求2至7任一项所述的试剂盒；所述方法包括以下步骤：

第一步、向透明反应管加入试剂盒2×反应液、引物混合液、酶液、显色液、超纯水，然后混合获得反应液；

第二步、向反应管中加入待测核酸样品，盖好反应管后混匀；

第三步、将反应管在恒温条件下放置进行RT-LAMP扩增，再于反应结束条件下放置以终止反应；

第四步、观察反应液的颜色，若反应液颜色为天蓝色，则待测核酸样品中含有GIV.1型诺如病毒；若反应液颜色为紫罗兰色，则待测核酸样品中不含GIV.1型诺如病毒。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征是，所述第二步中，加入待测核酸样品后，试剂盒2×反应液、引物混合液、酶液、显色液、超纯水及待测核酸样品的体积比为12.5：2.5：1：0.7：7.3：1，且反应管中反应液的体积为25μl；第三步中，RT-LAMP扩增条件为：62℃恒温条件下放置60min；所述反应结束的条件为：85℃下放置5min。