[发明专利]一种从生物体代谢物中筛选靶蛋白配体的方法

说明书

本发明公开了一种基于动态体积排阻色谱(KSEC)‑质谱联用技术从生物体代谢物中筛选靶蛋白内源性配体的方法。采用间隔进样模式依次将代谢物提取物和目标蛋白上样到体积排阻色谱柱中，由于蛋白分子尺寸远大于代谢物因此拥有更快的柱内迁移速度，故而目标蛋白会穿越代谢物提取物区段首先从柱内洗脱。通过固定代谢物提取物浓度不断提高目标蛋白浓度，利用非靶向代谢组学分析手段可从代谢物提取物中高通量筛选出与目标蛋白具有相互作用的代谢物。该方法不需要对蛋白质或代谢物进行额外标记或固载，将体积排阻色谱与质谱直接串联使得前处理流程更为简单，全过程不使用有机试剂从而提高对亲水性配体代谢物的筛选效果，是一种可靠的代谢物‑蛋白质相互作用高通量研究手段。

技术领域

本发明涉及分析化学和生物化学领域，是一种基于动态体积排阻色谱-质谱联用技术从生物体代谢物中筛选靶蛋白内源性配体的方法。

背景技术

在生物体内，代谢物除了在代谢转化过程中充当中间物外，还作为反应信号直接或间接的触发适应性反应，参与了如脂质合成、糖酵解途径、脂质分解、蛋白分解、三羧酸循环等生理过程。细胞的营养状态、外界压力及生态条件影响着细胞内成千上万种代谢物的水平，这些分子介导的信号是通过包括代谢物-蛋白质功能性相互作用在内的一系列分子事件进行传递。因而，深入研究内源性代谢物与蛋白质间相互作用，将有助于我们准确描述特定生物事件的内在机理并预测其生物学后果，更能为生物医药研发和农业发展中揭示新型分子实体

虽然代谢物-蛋白质相互作用研究具有极为重要的生物学意义，但基于代谢体系的复杂性以及缺乏系统性的研究手段，仅有一小部分相互作用网络得到了较为深入的研究。常见的代谢物-蛋白质相互作用研究策略包括放射性同位素标记法、荧光光谱法、等离子体表面共振、核磁共振法等，这些技术手段大多需要对蛋白质或相关配体进行标记、固载或其它额外前处理，这样难免会导致假阳性结果的发生，故而开发一种无标记、无固载的高通量代谢物-蛋白质相互作用筛选方法十分必要。

体积排阻色谱(SEC)是一种基于分子尺寸差异对被分析物进行分离的色谱分析手段。虽然其分辨率偏低，但由于柱内分子拥挤效应的存在，使其成为了代谢物-蛋白质相互作用研究的有利手段，尤其将其与质谱联用更扩展其研究通量。Muckenschnabel等人将蛋白质与小分子混合物孵育后，利用SEC去除未结合的小分子而对蛋白质区段馏分进行LC-MS分析，从而定性与蛋白具有相互作用的小分子，但受限于当时SEC的分辨率及组学发展的落后，其分析结果的准确度和分析通量尚待提高。Krylov等人开发了一种动态体积排阻方法将其应用于小分子-蛋白质相互作用(1对1体系)的动力学研究，具有较好的分析效果，但其分析通量较低，并未将组学思维渗入其中。

发明内容

本发明针对现有方法不足，建立了一种基于动态体积排阻色谱-质谱联用技术从生物体代谢物中筛选靶蛋白内源性配体的方法。该方法不需要对蛋白质或代谢物进行额外标记或固载，将体积排阻色谱与质谱直接串联使得前处理流程更为简单，全过程不使用有机试剂从而提高对亲水性配体代谢物的筛选效果，是一种可靠的代谢物-蛋白质相互作用高通量研究手段。

本发明采用的技术路线如下：

第一步：采用间隔进样模式将代谢物提取物及空白的流动相先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；

第二步：采用间隔进样模式将代谢物提取物及目标靶蛋白先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；固定代谢物提取物上样量使其与步骤(1)相同；

第三步：采用间隔进样模式将代谢物提取物及目标靶蛋白先后依次上样到体积排阻色谱柱中进行分离，并利用质谱进行在线分析；固定代谢物提取物上样量使其与步骤(1)相同，并使靶蛋白浓度高于步骤(2)。

第四步：重复步骤(3)3次，并分别利用质谱进行在线分析。