[发明专利]一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC及其应用

说明书

一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明细胞株CBC，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17398。将三氯杀螨醇的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。经首免、多次加强免疫、及冲刺免疫。将高效价，低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经选择培养，再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到细胞株CBC，其分泌的单克隆抗体，对三氯杀螨醇具有较好的检测灵敏度（IC₅₀值为19.09 ng/mL），可以用于食品中三氯杀螨醇的残留检测。

技术领域

本发明涉及一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

三氯杀螨醇 [2,2,2-三氯-1,1-双(4-氯苯基)乙醇]，英文名称dicofol（以下简写为DCF），是农牧业生产中常用的一种广谱、低毒有机氯杀螨剂，对螨类有触杀和胃毒作用，对成螨、幼螨及卵均有效。三氯杀螨醇的生产与合成以滴滴涕为原料，在生产过程中氯化工段的转化率一般为 70%左右，若后续未进行提纯或提纯不彻底，则成品中就不同程度地含有滴滴涕。

三氯杀螨醇的大量使用将导致残留量超标，近些年来已有越来越多的证据表明，其在环境中的暴露对鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类和人类有毒性和雌激素效应，对水生生物有极高毒性。给人类的健康带来危害。世界上部分国家已禁止在茶树上使用三氯杀螨醇农药，部分国家也严格限制使用高残留的三氯杀螨醇农药。我国国标GB 2763-2016中规定水果中三氯杀螨醇最大残留限量为1mg/kg，茶叶中最大残留限量为0.2mg/kg。

目前，三氯杀螨醇检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，但存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析三氯杀螨醇残留物的方法。

酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测三氯杀螨醇的前提是得到对三氯杀螨醇具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对三氯杀螨醇具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备三氯杀螨醇单克隆抗体，但在制备能分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备三氯杀螨醇半抗原和三氯杀螨醇完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出三氯杀螨醇单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的三氯杀螨醇单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC及其应用，此杂交瘤细胞株分泌的三氯杀螨醇单克隆抗体对三氯杀螨醇具有较好的检测灵敏度（IC₅₀值为19.09ng/mL），可以用于建立三氯杀螨醇的免疫学检测方法，检测食品中三氯杀螨醇的残留。

本发明的技术方案，一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17398。

本发明提供了上述一株分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株CBC的制备方法，包含如下步骤：

（1）制备三氯杀螨醇半抗原及三氯杀螨醇完全抗原，将获得的三氯杀螨醇完全抗原制备成完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；