[发明专利]色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，属于蛋白质工程领域。本发明色氨酸2,3双加氧酶突变体由色氨酸2,3双加氧酶的氨基酸序列在第51位和第127位进行突变得到。本发明构建的生物催化剂可以利用不带有保护基的色氨酸、5‑氯色氨酸和6‑氯色氨酸作为底物，一步合成3a‑羟基六氢吡咯[2,3‑b]吲哚‑2‑羧酸（HPICs）及其衍生物。该新型酶将色氨酸双加氧酶转化为单加氧酶，其产生HPICs的量远远大于野生型色氨酸2,3双加氧酶产生HPICs的量，具有优秀非对映选择性；反应和纯化过程均在环保的水溶液中，在室温下进行，反映体系简单，反应条件温和，低能耗。

技术领域

本发明涉及一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，属于蛋白质工程领域。

背景技术

三元环的3a-羟基六氢吡咯 [2,3-b]吲哚-2-羧酸及衍生物（简称HPICs）是许多生物碱和多肽类中常见的分子骨架，具有强大的结构多样性和生物活性。例如，kapakahine C对P388小鼠白血病细胞具有细胞毒性；NWG家族中大部分天然产物(如NWG01)对革兰氏阳性菌的抗菌活性强于对革兰氏阴性菌的抗菌活性。除了抗菌活性外，himastatin和chloptosin还能抑制几种癌细胞系的生长。因此，含有HPICs结构单元的天然产物是合成和药理学研究的热门目标。HPIC还可以被氧化成pyrrolobenzoxazine合成中有用的中间体，例如：paeciloxazine、CJ12662 和 CJ12663。此外，具有HPICs骨架的单环肽可以利用酶法转化为生物活性提高的双环肽。因此，HPICs除了存在于各种各样的生物活性分子中，它也是重要的合成中间体。

由色氨酸衍生物构建HPICs已被成为有机化学合成领域研究的热点。早先，Danishefsky能够以游离的Trp为底物，通过3-4步制备非对映选择性的HPICs，这为合成复杂的天然产物提供了有力策略。这些阳离子引发的环化反应利用N-苯基硒代酞酰亚胺(N-PSP)或N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)等亲电试剂来激活吲哚环;然后通过间氯过苯甲酸(mCPBA)或AgNO₃水溶液氧化脱氮，实现氧原子取代活化的杂环原子。与上述分步方法不同，DMDO的氧化可以直接将 Trp 衍生物转化为 HPICs，但非对映选择性取决于羧基和胺基的保护基团。如果没有像三苯甲基(Tr)和叔丁基(tBu)这样庞大的保护基团，得到的HPIC是1:1非对映体的混合物。最近，自由基引发的环化也被用于从受保护的Trp衍生物逐步制备HPIC。尽管取得了显著的进步，但是在制备HPIC的过程中需要多个保护基团，这不是一种环保的合成方式。为了解决这一问题，Nakagawa研究者已经尝试利用光敏通过两步/一锅法氧化未受保护的色氨酸，包括被Me₂S还原裂解生成的三环过氧化物。反应过程虽然简单，但这种方法的立体选择性很差。此外，不稳定的过氧化物中间体易于迅速分解成N’-甲酰基犬尿氨酸(NFK)。

2011年研究发现，色氨酸2,3双加氧酶xcTDO可以催化色氨酸通过一步反应生成HPIC，这为产生HPIC提供了一种新思路，但是由于反应主要生成NFK，HPIC产量极低的问题，限制了此酶合成HPICs的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种色氨酸2,3双加氧酶突变体及其制备方法和应用，制备的色氨酸2,3双加氧酶突变体产生HPICs的量远远大于野生型色氨酸2,3双加氧酶产生HPICs的量，具有优秀非对映选择性。

为解决上述技术问题，本发明提供一种色氨酸2,3双加氧酶突变体，含有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供编码上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供包含上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的核苷酸的载体。

本发明还提供表达上述色氨酸2,3双加氧酶突变体的细胞。