[发明专利]一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法及其应用在审
| 申请号： | 201910955182.0 | 申请日： | 2019-10-09 |
| 公开（公告）号： | CN110551749A | 公开（公告）日： | 2019-12-10 |
| 发明（设计）人： | 崔格特 | 申请（专利权）人： | 武汉博欧特生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/78 | 分类号： | C12N15/78;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/40 |
| 代理公司： | 42247 武汉红观专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 张文俊 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 恶臭假单胞菌 自杀载体 靶基因 构建 敲除 基因敲除 复制子 同源臂 质粒 复制 基因缺失突变株 抗生素抗性筛选 大肠杆菌 缺失突变株 接合 正确率 替换 上游 基因 应用 转化 | ||
1.一种恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
S2、以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增得到R6K复制子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
S3、将步骤S1所述DNA片段与步骤S2所述R6K复制子均用限制性内切酶NdeI进行酶切，然后连接得到载体pBR6K；
S4、以恶臭假单胞菌基因组总DNA为模板，扩增得到待敲除靶基因x的上游同源臂，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup；
S5、以pTnmod-RKm’质粒为模板，扩增得到卡那霉素抗性基因，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup-kan；
S6、以恶臭假单胞菌基因组总DNA为模板，扩增得到待敲除靶基因x的下游同源臂，然后连到载体pBR6K上，得到载体pBR6K-xup-kan-down。
2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌自杀载体的构建方法，其特征在于：所述待敲除靶基因x的上游同源臂和下游同源臂的长度分别为600bp-1000bp。
3.一种利用权利要求1所述方法构建的恶臭假单胞菌自杀载体构建恶臭假单胞菌基因缺失菌株的方法，其特征在于：将所述恶臭假单胞菌自杀载体经转化导入供体菌中，然后将此供体菌与受体菌混合，经接合转移将恶臭假单胞菌自杀载体转移进入受体菌，通过卡那霉素和庆大霉素共同筛选，获得所述待敲除靶基因缺失的菌株。
4.一种利用权利要求1所述方法构建的恶臭假单胞菌自杀载体构建恶臭假单胞菌基因缺失菌株的方法，其特征在于：将所述恶臭假单胞菌自杀载体直接转化到恶臭假单胞菌中进行培养发生同源交换，通过卡那霉素和庆大霉素共同筛选，获得所述待敲除靶基因缺失的菌株。
5.利用权利要求1所述方法构建的恶臭假单胞菌自杀载体在恶臭假单胞菌的基因敲除中的应用。
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