[发明专利]乳腺特异性表达抗k88ac抗原抗体基因的同源重组载体及应用

说明书

本发明提供一种乳腺特异性表达抗k88ac抗原抗体基因的同源重组载体及应用。所述同源重组载体是以真核表达载体为骨架载体，同源重组载体中至少包括正筛选元件、负筛选标记基因、抗k88ac抗原抗体基因表达盒以及rosa26基因的同源左臂和同源右臂；其中，正筛选元件包括顺次连接的重组酶识别序列‑正筛选标记基因‑重组酶基因‑重组酶识别序列。利用所述同源重组载体转染哺乳动物体细胞，获得的阳性细胞rosa26基因第一个内含子定点整合抗k88ac抗原抗体基因；利用本发明方法成功获得了乳腺特异性表达抗k88ac抗原抗体的转基因猪细胞系，为通过转基因技术制备抗腹泻转基因猪奠定基础。

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，具体地说，涉及一种乳腺特异性表达抗k88ac抗原抗体基因的同源重组载体及应用。

背景技术

仔猪腹泻在养猪业危害中居首位，严重威胁着养猪业的健康发展，是集约化养猪生产条件下的一种典型的多因素性疾病。而哺乳仔猪以传染性腹泻较为常见，尤其以携带k88ac菌毛蛋白的大肠杆菌引起的仔猪腹泻最为常见。

大肠杆菌k88ac菌毛蛋白属于大肠杆菌纤毛抗原的一种，是蛋白质，不耐热，位于菌体表面，与菌株的肠病原性有着密切的关系。大肠杆菌k88ac是引起仔猪腹泻的主要病原，大肠杆菌k88ac菌毛蛋白则作为一种粘着因素在猪体内发挥作用，使大肠杆菌固着于前部肠道的粘膜绒毛上，产生肠毒素，引起常见的仔猪腹泻病。

然而，目前对于k88ac大肠杆菌并没有很好的单克隆抗体用以抵御k88ac大肠杆菌对仔猪危害，导致仔猪腹泻病仍然是威胁养猪业的一大原因。迄今为止，国内尚未见有特异性结合大肠杆菌k88ac，并可有效发挥免疫抗性的单链抗体的报道。因此，本发明人通过生物技术手段获得了抗k88ac大肠杆菌的单链抗体，同时具有显著的抑菌效果，提示可以通过转基因技术制备抗腹泻转基因猪、降低我国仔猪腹泻发病率的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳腺特异性表达抗k88ac抗原抗体基因的同源重组载体及应用。

本发明构思如下：通过基因工程手段(通过构建乳腺特异性表达抗k88ac抗原抗体基因的同源重组载体)将抗k88ac抗原抗体基因转入猪成纤维细胞内，并使其在乳腺特异表达，从而增加乳汁中抗k88ac抗原抗体的含量，针对乳猪达到降低仔猪腹泻发病率的目的。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供乳腺特异性表达抗k88ac抗原抗体基因的同源重组载体，所述同源重组载体是以真核表达载体为骨架载体，所述同源重组载体中至少包括正筛选元件、负筛选标记基因、抗k88ac抗原抗体基因表达盒以及rosa26基因的同源左臂和同源右臂。

优选地，所述同源重组载体是以载体BAC作为骨架载体。

其中，所述正筛选元件包括顺次连接的重组酶识别序列-正筛选标记基因-重组酶基因-重组酶识别序列。

所述正筛选元件的一端与所述同源左臂连接，另一端与所述抗k88ac抗原抗体基因表达盒连接；所述抗k88ac抗原抗体基因表达盒的另一端与所述同源右臂连接，同源右臂的外侧连接有负筛选标记基因。

优选地，所述正筛选标记基因包括但不限于编码新霉素磷酸转移酶(Neo)、潮霉素B磷酸转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或嘌呤霉素乙酰转移酶的基因。

优选地，所述负筛选标记基因包括但不限于编码白喉毒素或胸腺去氧核苷的基因(dTA)。

本发明所述重组酶基因包括编码Cre酶或Flp酶的基因。

优选地，所述同源重组载体中的正筛选元件为Loxp-OCT4启动子 -Cre-PGK-Neo-Loxp。其中，Cre表达框由胚胎期特异性启动子OCT4调控。所述新霉素Neo作为正筛选标记，dTA为负筛选标记。LoxP位点位于Cre表达框上游和Neo表达框下游。