[发明专利]新型碱性蛋白酶抑制肽的筛选

说明书

本发明涉及新型碱性蛋白酶抑制肽的筛选，通过体外RNA展示筛选技术获得了芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶的新型八肽抑制肽，该抑制肽能够增强液体制剂中碱性蛋白酶的稳定性，有望应用于液体酶制剂和加酶液体洗涤剂。

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及芽孢杆菌来源碱性蛋白酶的新型抑制肽的筛选。

背景技术

碱性蛋白酶在碱性条件下水解蛋白效率最高。广泛应用于洗涤、食品、医药、制革等行业，其中洗涤行业用量约占全球碱性蛋白酶需求量的。以芽孢杆菌来源为主的微生物产碱性蛋白酶是主要的液体洗涤剂添加用酶，其在碱性条件下去污能力较高，对血渍、汗渍、油渍等蛋白类污垢效果最佳。蛋白酶会由于自切而失活，因而液体含酶洗涤剂在保存过程中需要添加抑制剂，以避免碱性蛋白酶水解自身而降低洗涤性能。目前液体洗涤剂中广泛使用的蛋白酶抑制剂是硼酸类抑制剂，对环境和人体健康并不友好，根据动物毒理性试验表明硼酸类物质为第二类生殖毒性化合物，长期使用存在非常大的生殖毒性风险。因此，迫切需要开发绿色、环保和安全性高的新型碱性蛋白酶抑制剂，目前多肽类抑制剂是一个主要的研究方向。

本发明工作试图通过mRNA体外展示技术筛选获得碱性蛋白酶的抑制肽。mRNA体外展示技术，在筛选效能上具有高库容量高灵敏度等优势。其核心技术特征在于，肽库的RNA序列与其翻译的对应氨基酸序列通过连接子(linker)形成了mRNA-linker-多肽融合分子，并用于亲和肽筛选，所获亲和肽序列可以通过共价连接的cDNA的PCR扩增和高通量测序实现超高灵敏度的鉴定。在筛选过程中，mRNA与其编码的多肽或蛋白质共价结合，形成mRNA-蛋白质融合体，能在大容量的多肽文库(10¹³～10¹⁵)中筛选具有特定生物学功能的多肽和蛋白。然而，mRNA体外展示技术的成功建立和应用却极具挑战性。国内外尚未有报道利用mRNA体外展示技术筛选碱性蛋白酶的抑制肽。

发明内容

本发明的目的在于，通过mRNA体外展示筛选技术，为芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶筛选新型的多肽类抑制剂。

本发明实现目的的技术方案如下：

通过mRNA体外展示方法初筛碱性蛋白酶的候选抑制肽，并通过对酶活抑制率的测定确定验证碱性蛋白酶的抑制肽，步骤如下：

(1)特殊设计与合成的DNA库，经过体外转录、linker光交联、体外翻译和纯化、反转录等步骤获得基因型表型融合分子库，即mRNA-linker-多肽融合分子库；

(2)通过链霉亲和素磁珠固定生物素修饰的芽孢杆菌来源碱性蛋白酶；

(3)随后将mRNA-linker-多肽融合分子库与磁珠固定的碱性蛋白酶进行孵育筛选，筛选获得的亲合肽通过PCR扩增其DNA后进入下一轮筛选。

(4)经多轮筛选最终捕获得到高亲和力的融合分子，并通过PCR扩增和DNA测序实现候选抑制肽的序列鉴定。

(5)测定抑制肽对芽孢来源碱性蛋白酶酶活的抑制率，确认抑制肽对碱性蛋白酶的抑制性能。

mRNA体外展示筛选获得的芽孢杆菌来源碱性蛋白酶的抑制肽，在序列上呈现如下特征，其中，从N端起N1位置氨基酸为酪氨酸或者组氨酸；N2位置为半胱氨酸或者色氨酸；N1-N7位置所含氨基酸的种类包括组氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、精氨酸、丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、苏氨酸、色氨酸和谷氨酸，多肽序列的羧基端位点C1位置为酪氨酸、亮氨酸或者组氨酸。八肽序列中氨基酸位置的命名为：从N段开始各个氨基酸位置依次为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、C1。