[发明专利]新型抗自切碱性蛋白酶的筛选

说明书

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种新型的能够抗自切的碱性蛋白酶突变体的筛选。本发明通过对克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶进行改造和筛选获得了抗自切性能优异的突变体，突变体的基因在第493‑495位突变为GAT，第799‑801位为GAT，相应的氨基酸序列分别是在第161位突变为Thr，第183位为Asp。在40℃恒温孵育48h后，碱性蛋白酶突变体的酶活保留率比野生型碱性蛋白酶的酶活提高了40％以上。抗自切碱性蛋白酶分子的筛选，有助于改善碱性蛋白酶的储存和应用效果。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及新型抗自切碱性蛋白酶的筛选

背景技术

碱性蛋白酶(alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的一类酶，其最适pH一般为9～11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，分子量约为27kDa。碱性蛋白酶主要应用于加酶洗涤剂工业，同时也广泛应用在食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业，是工业用酶中占据比例最大的酶类。

微生物来源的碱性蛋白酶位点特异性比较弱，因此在肽键羧基侧具有芳香族的氨基酸或疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸)都可以成为碱性蛋白酶的切割位点，这种广泛的位点选择性可以使碱性蛋白酶快速水解底物，因此普遍应用于食品工业。然而，这种水解位点的广泛性同时加剧了碱性蛋白酶在水解底物中的自切现象。在一般介质中，两个碱性蛋白酶分子相互碰撞，位于蛋白酶表面的特异性氨基酸位点成为了首要切割对象，尤其是当存在于β-转角、loop这种较为松散的二级结构上的氨基酸被切割后，可能会引起碱性蛋白酶的活性中心裸露，活性中心被识别切割后导致蛋白酶迅速失活。在长时间的运输保存过程中，极易发生自切，造成酶活的大量损失，为了让蛋白酶长时间保持活力无疑增加了很大的生产成本。因此目前急需开发一种能较长时间保持高酶活力的碱性蛋白酶产品。

本发明针对碱性蛋白酶表面特异性氨基酸的查找分析确定易自切位点，随后通过Discovery Studio软件进行虚拟氨基酸突变确定最佳突变的氨基酸类型。本发明是为了提供一种能够在酶活不降低的情况下且能抗自切的碱性蛋白酶突变体。所述突变体是由克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)碱性蛋白酶基因aprE的成熟肽出发，通过分子模拟和定点突变等技术获得的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够抗自切的碱性蛋白酶突变体。本发明以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过对碱性蛋白酶表面疏水氨基酸的查找分析确定易自切位点，随后通过Discovery Studio软件进行虚拟氨基酸突变确定最佳突变的氨基酸类型。之后通过设计引物进行反向PCR技术引入突变位点，获得了2个碱性蛋白酶突变体pQY-5、pQY-6，并分别构建了表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌QY-5，QY-6，发酵48h后酶活分别为27U/mL、31U/mL，比重组表达野生型碱性蛋白酶aprE的酶活分别提高了17％、38％。碱性蛋白酶突变体的酶活保留率比野生型碱性蛋白酶的酶活提高了41％、70％。

实现本发明目的技术路线概述如下：

通过对碱性蛋白酶表面疏水氨基酸的查找分析确定易自切位点，随后通过Discovery Studio软件进行虚拟氨基酸突变确定最佳突变的氨基酸类型。以克劳氏芽孢杆菌基因组为模板，根据GenBank：FJ940727.1克隆得到碱性蛋白酶基因aprE，将其构建在表达载体pWB600上，该基因序列为野生型的碱性蛋白酶基因(SEQ ID NO：1)，之后通过反向PCR技术引入突变位点，对野生型碱性蛋白酶基因定点突变，得到突变体基因(SEQ ID NO：3，5)，构建重组载体，将其转化进枯草芽孢杆菌WB600中进行发酵产酶实验验证，得到能够有效抗自切的碱性蛋白酶突变体。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。