[发明专利]一种微生物源氨基肽酶及其制备与应用

权利要求书

1.一种微生物源氨基肽酶，其特征在于，该氨基肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述氨基肽酶在食品工业和生物制药行业作为蛋白质或多肽的水解酶的应用。

3.权利要求1所述氨基肽酶的制备方法，其特征在于，是以单核细胞增多性李斯特菌野生株的基因组DNA为模版进行PCR扩增反应，获得含有氨基肽酶目的基因且该基因含有酶切位点的目的片段；将目的基因与载体以限制性内切酶Kpn I和BamH I进行双酶切，然后将目的基因连接入表达载体pET30a(+)；连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α感受态细胞中，在Kana/LB固态琼脂培养基上进行培养；将阳性克隆重组菌质粒入感受态细胞E.coliRosetta中，取单克隆菌落进行扩大培养，经超声破碎、咪唑洗脱和镍离子树脂柱亲和层析，分离纯化得到重组蛋白，即所述微生物源氨基肽酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)采用特异性引物对李斯特菌野生株的基因组DNA进行扩增，扩增同时在引物上设计Kpn I和BamH I的酶切位点，所述特异性引物的序列分别为：

上游引物：5’-CGGGGTACCATGACAGTATTTAGTGAAAAGTTAGAAAAGTATGC-3’；下游引物：5’-CGCGGATCCTTAGAACGCCCAGTCGCCTTTA-3’；

PCR扩增体系为：KOD-plus-Neo 1μL，10×PCR Buffer for KOD-plus-Neo 5μL，MgSO₄ 3μL，dNTPs 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板2μL，加ddH₂O至50μL；PCR扩增条件为：94℃预变性30s，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min 30s，循环25～35次，最后68℃延伸8～12min；

(2)以限制性内切酶Kpn I和BamH I分别双酶切pET30a(+)质粒和扩增产物，电泳后回收目的产物，然后用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，将目的基因与载体连接；将连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，涂布在Kana/LB琼脂固态培养基上，37℃过夜培养，获得重组菌株；在Kana/LB琼脂固态培养基中进行培养，卡那霉素浓度为50mg/L，琼脂浓度为1.5％；

(3)挑取重组菌株单克隆至5mL Kana/LB琼脂液体培养基中，37℃过夜；培养后抽提质粒，测序；

(4)将测序正确的质粒转化至E.coli Rosetta中，过夜培养；然后挑取重组菌株单克隆至500mL Kana/LB培养基中，在37℃、150r/min下培养；待培养至OD_600nm＝0.6时，加入终浓度为0.6mM的IPTG，在30℃、100～300r/min诱导8h，得到蛋白诱导表达菌液；将菌液3700r/min离心15min，弃上清，收集沉淀；然后加入30mL、50mM的PBS，用细胞超声破碎仪将细胞裂解；离心3700r/min离心15min收集上清，上清液与镍柱结合4℃、4h，然后过柱纯化；使用30mL、50mM咪唑洗脱杂蛋白，再以6-8mL、400mM咪唑洗脱目的蛋白，最终得到纯化的活性蛋白，即所述微生物源氨基肽酶。