[发明专利]一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，包括以下组成：

(1)包被有1μg·mL^-1抗原OLA-A-OVA的反应板；-A-表示-CO(CH₂)₅COO-；抗原OLA-A-OVA为：

(2)铕标记的喹乙醇单克隆抗体溶液：含0.5ng·mL^-1的Eu³⁺-OLA-mAb，质量百分含量为1％BSA，质量百分含量为0.2％叠氮化钠，基础缓冲体系为0.01mol·L^-1，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液与等体积的甘油混合而成；

(3)喹乙醇标准品母液1μg·mL^-1；

(4)反应增强液：含0.27mmol·L^-1а-噻吩甲酰三氟丙酮，0.5mmol·L^-1三辛基氧化膦，体积分数为0.05％无水乙醇，体积分数为5.9％冰乙酸，体积分数为0.25％的TritonX-100，6.8mmol·L^-1的邻苯二甲酸氢钾，pH为3.0，余量为去离子水；

(5)浓缩洗液：100mmol·L^-1、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，且该缓冲液中含有体积百分比浓度为0.5％的吐温20。

2.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，反应板为96孔板，材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

3.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，铕标记的喹乙醇单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)喹乙醇半抗原的合成

向三口圆底烧瓶中准确加入2.106g喹乙醇和2.274g的oxocane-2,8-dione，加入80-90mL吡啶，115℃下回流反应5-6h后减压蒸除吡啶，向剩余混合物中加入60mL冰蒸馏水，2mol·L^-1HCl调pH至2.0～3.0，4℃下放置过夜；减压抽滤并用冰蒸馏水洗涤后抽干，得到的物质即为喹乙醇半抗原OLA-A，-A表示-CO(CH₂)₅COOH；具体的合成路线如下：

(2)喹乙醇人工抗原的合成

取0.04mmol OLA-A溶于0.8-1.0mL DMF中，加入0.04mmol N-羟基琥珀酰亚胺和0.04mmol二环己基碳二亚胺，室温下避光搅拌反应10-12h后2000r·min^-1离心10min，离心后上清液为a液；

称取20mg OVA或BSA溶于5mL 0.01mmol·L^-1，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，此为b液；

4℃下将0.6mLa液逐滴加入到b液中，4℃搅拌反应过夜；次日转入透析袋内，0.01mmol·L^-1，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液透析2天，离心弃沉淀，得到交联产物，命名为OLA-A-OVA或OLA-A-BSA，-A-表示-CO(CH₂)₅COO-；具体的合成路线如下：

或者

(3)小鼠免疫：

选择6-8周龄BALB/C雌性小鼠，将制备的免疫原OLA-A-BSA与等体积弗氏完全佐剂采用注射器加压充分混合乳化后，腹部和腋下多点注射，后每间隔21天进行加强免疫，3次加强免疫后采血测定效价，效价采用间接ELISA方法测定，当效价不再明显升高时进行末免，末免3天后进行细胞融合，免疫过程中第一次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫采用弗氏不完全佐剂，末免不使用佐剂，直接免疫原注射免疫；

(4)细胞融合与细胞株筛选：

在末免3天后，按照常规PEG方法进行细胞融合，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按照5～10：1的比例进行融合，间接ELISA筛选阳性孔，并对阳性孔进一步利用间接竞争ELISA测定阳性孔的抑制效果，对抑制效果好的杂交瘤细胞用有限稀释法进行3～4次克隆，筛选获得杂交瘤细胞株；

向BALB/C小鼠腹腔注射降植烷，0.3mL/只，7～10天后同法注射杂交瘤细胞株细胞，待小鼠腹腔明显胀大后抽取腹水，离心除去油脂沉淀后，即得小鼠腹水；

腹水纯化后，得到抗喹乙醇单克隆抗体；

(5)Eu³⁺-OLA-mAb的制备

A.5mL纯化好的喹乙醇单克隆抗体与0.5mL 0.01mol·L^-1pH为7.4的磷酸盐缓冲液1:1混合；

B.称取3.0mg环化二乙烯三胺五醋酸酐，加入90μL DMSO溶解；

C.将90μL步骤B中的溶液缓慢滴加到步骤A中溶液，用0.125mol·L^-1NaOH调pH至9.0，室温避光放置2h；

D.将步骤C最终的反应液转移至透析袋中，0.01mol·L^-1pH＝7.4磷酸盐缓冲液透析过夜；

E.准确称取0.242g EuCl₃·6H₂O于20mL水中配成3.3×10^-2mol·L^-1EuCl₃溶液；

F.取100μL步骤E中的溶液加入步骤D中，室温避光反应3h后置于透析袋中透析24h～36h，分装保存于-20℃，即得到铕标记喹乙醇单克隆抗体Eu³⁺-OLA-mAb。