[发明专利]一种同步使用信使RNA与基因组DNA模板检测基因变异的方法

说明书

本发明公开了一种同步使用信使RNA与基因组DNA模板进行高通量测序的文库构建，以检测对应的基因变异类型的方法，该方法包括对总核酸样本进行反转录、接头连接、靶标特异性线性扩增，然后使用巢式靶标特异性引物对靶序列进行扩增。本发明的检测方法基于基因组DNA与信使RNA序列的差别，设计对应的引物，从而达到在一个反应体系中同时检测出两种核酸模板中融合与突变的目的。

技术领域

本发明涉及基因变异检测技术领域，尤其是一种同步使用信使RNA与基因组DNA模板进行高通量测序检测基因变异的方法。

背景技术

真核生物的基因由外显子及内含子交替组成。内含子占基因序列的大部分，以ALK基因为例，全长为728kb(千碱基，以下同)，其中外显子为6kb，其余为内含子序列。基因通过转录反应合成前体RNA(hnRNA)，再通过剪切反应去除内含子序列，使外显子拼接成为信使RNA(mRNA)，用于翻译合成蛋白(如图4)。

肿瘤的基因变异可大致划分为：单碱基置换突变(SNV)、插入/缺失突变(Indel)、DNA拷贝数变异(CNV)、基因融合、RNA表达量差异。单碱基置换突变及插入/缺失突变合称突变，在肿瘤中最为常见，如单是EGFR一个基因的突变就占到中国肺癌患者的约40％。基因融合，又称染色体重排或易位，是正常基因组中位于不同区域的两个或以上序列发生断裂重组从而拼接成一段新的序列。一些特殊的变异，如一段序列的倒置，或基因的异常剪切，也可被归为融合。基因融合是一种常见的肿瘤发生机制，也是靶向治疗的重要靶点，如肺癌中多发的EML4-ALK基因融合，为克唑替尼的作用靶点。

高通量测序技术在过去的十年里彻底改变了基因组学领域。每次运行可并行获得数百万条以上的序列信息。靶向测序是指针对指定的靶标区域进行的高通量测序，提供了具有适当广度和深度的测序数据，从而允许检测临床相关的基因变异。肿瘤基因变异的复杂性决定了靶向测序是有效发现变异的手段，针对的靶标区域为肿瘤基因的特定位点，如药物作用的靶点或揭示肿瘤分型或疗效的分子生物标志物。

组织样本含有两类核酸，DNA主要由染色体的基因组DNA、线粒体DNA及染色体外DNA构成，RNA由未剪切修饰的前体RNA、剪切修饰的信使RNA、非编码RNA(ncRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)构成。靶向测序可使用基因组DNA(gDNA)为模板，也可使用信使RNA(mRNA)为模板构建文库，各有优劣。靶向测序的关键是选择性地从核酸样本中捕获或富集靶标区域。发生在外显子上的突变造成信使RNA序列改变，进而导致蛋白的氨基酸变异而改变其功能，而内含子发生的突变则在剪切反应中被去除，不会传导为氨基酸变异。所以检测突变适合使用基因组DNA为模板，只需要将靶标区域设为基因的外显子，而无需检测内含子。

但是基因融合则不同，无论拼接点的发生区域，融合均导致嵌合体蛋白的产生。因此，如果使用基因组DNA为检测模板就需要不仅要覆盖外显子也要覆盖内含子，造成靶标区域过大。而如果使用信使RNA为模板就只需要覆盖剪切反应形成的嵌合体信使RNA产物即可，极大压缩了需要覆盖的靶标区域。

然而，突变在基因组DNA模板上可通过上下两条互补链同一位置的碱基改变进行验证，而信使RNA模板为单链无法进行这种验证。信使RNA的化学性质也较不稳定，容易因水解、环境因素、转录差错等造成碱基缺损，因此不适合用于检测突变。另外，在一些情况下，如血浆游离肿瘤核酸的液体活检，或长期保存降解严重的组织样本，无法获得可供检测的信使RNA，此时只能使用基因组DNA为模板检测融合。

由于在肺癌等实体肿瘤中突变占据主要比例，目前的高通量测序还是以基因组DNA建库为主流，而以信使RNA检测融合为补充。在近年来，融合变异的重要性及检测困难得到高度重视，但在临床实践中分别做DNA测序和RNA测序的使用成本、检测周期、样本品质均不理想，诸如活检样本和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片等临床样本，仅提供了少量的起始材料，难以满足两次检测的用量。