[发明专利]大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法

说明书

本发明公开了一种大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，主要包括以下步骤：菌种制备，一级液体菌种的制备，二级液体菌种的制备，生产培养基配制、接种、培养，菌丝体和胞外多糖的收集，菌丝体采用离心法或过滤法进行收集，离心所得上清液或过滤法获得的滤液，经减压浓缩后，用醇沉法分离多糖，多糖进行冷冻干燥，制成多糖冻干粉。本发明采用大盖小皮伞液体培养生产方式，具有快速、高效且简便的优点，液体培养所得的产物较为简单，更易于提取、分离及纯化，可实现大盖小皮伞菌丝体及胞外多糖的量产，以达到满足市场需求的目的，解决野生资源难收集、量少等问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法。

背景技术

小皮伞属(Marasmius)是一类具有一定药用价格的大型真菌，其中最著名的是安络小皮伞(Marasmiellus androsaceus)，这是一种传统的药用真菌，也是安络痛的主要原料，具有通经活络，活血止痛的作用，用于坐骨神经痛，三叉神经痛，风湿性关节痛等。我国民间常用它的菌丝来治疗跌打损伤、骨折、坐骨神经痛、偏头痛、风湿关节痛等。经现代药理试验证实，安络小皮伞多糖是安络小皮伞的重要活性成分之一，具有改善免疫抗性、预防肿瘤及消除自由基等多种功能。安络小皮伞的菌丝体内含有的糖类等活性成分可以作为食品和保健品的添加成分，对提高人体的免疫力和延缓人体衰老有较好的作用。

大盖小皮伞(Marasmius maximus)与安络小皮伞均隶属于口蘑科(Tricholomataceae)，小皮伞属(Marasmius)，春季或夏秋季林中腐枝落叶层上，散生、群生或有时近丛生，较为常见。发明人所在团队以自然状态下的大盖小皮伞为材料进行菌种分离，进行其人工培养研究，并进行了抗氧化活性分析，研究结果表明，大盖小皮伞菌丝体及胞外多糖均具有抗氧化活性作用，大盖小皮伞水提物对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率达90%以上。利用秀丽隐杆线虫作为模式生物进行的抗氧化实验和寿命实验结果显示，大盖小皮伞菌丝体水提物及胞外多糖对秀丽隐杆线虫有一定的抗氧化作用，且随着样品浓度的提高，抗氧化能力越强；水提物对线虫的寿命延长也有一定的促进作用，样品浓度越高，线虫的存活时间越久，存活率也会提高。而成分测定结果显示，大盖小皮伞菌丝体含有丰富的活性成分，包括：黄酮、多酚、多糖等。可见，大盖小皮伞可作为抗氧化剂的生物原料，具有较大的经济价值和一定的科学意义。尽管大盖小皮伞在野生条件下较为常见，但由于其个体偏小，不易分离，而且单纯靠人工采摘是难以满足市场需求的，同时，过度的采摘也会造成野生资源的破坏。

发明内容

本发明针对背景技术中的不足，提供了一种大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，通过本发明可实现大盖小皮伞菌丝体及胞外多糖的量产，并将两者进行有效的提取、分离和纯化。

为实现上述目的，本发明技术解决方案如下：

大盖小皮伞(Marasmiusmaximus)菌种：该菌株分离来自大盖小皮伞野生子实体，利用组织分离法，挑取子实体少量菌丝，接种至PDA培养基上，菌种经检查确保无其他杂菌后，用于培养生产，所得的菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M2019228，保藏日期为：2019年4月3日，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。

大盖小皮伞液体培养生产菌丝体及胞外多糖的方法，包括以下步骤：

（1）菌种制备：将大盖小皮伞菌种接种在PDA试管培养基上，于20-25℃下暗培养10-15天后，置于4℃左右的冰箱中保存备用；