[发明专利]高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株及其构建方法

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的大肠杆菌菌株的构建及应用。技术方案为：一种高产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的大肠杆菌，在所述大肠杆菌中引入L‑脯氨酸‑反式‑4‑羟化酶基因；所述大肠杆菌的putA基因、poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因、adhE基因、aceA基因被敲除；对proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑；对proA的5＇UTR序列进行编辑；对proB基因引入I69E突变。使用本发明构建的工程菌及发酵方法，可以葡萄糖为原料，在不外加L‑脯氨酸等底物的情况下，从头开始高效合成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸，最高产量可达4.82g/L。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株的构建及应用。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline，简称HYP)是L-脯氨酸的4-羟基化产物，是胶原蛋白的主要组成氨基酸，被广泛应用于医药、化工、饲料、食品营养和美容等行业。HYP的主要制备方法为酸水解法：以胶原蛋白为原料，通过酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程获得。但存在原料消耗量大、三废排放量大、能耗高、终产物纯度低、生产成本高等缺点。另外，虽然也可通过化学合成的方法制备HYP，但又存在合成路线较长、成本太高、难以产业化等缺陷。与之相对的，微生物发酵法因具有原料成本低、反应条件温和、易大规模生产等优势，逐渐成为广受关注的化合物合成新方法；为HYP的合成提供了新思路。

Yulan Yi等将来源于不同物种的L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因(P4H)构建到大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌表达载体上，直接转化大肠杆菌BL21(DE3)或者谷氨酸棒杆菌，在MEC培养基中进行摇瓶发酵。结果发现，来源于指孢囊菌RH1的P4H活性最好，其在大肠杆菌中生成的HYP的量最高--在不添加脯氨酸的情况下，OD_600nm为6.5左右时，HYP的产量可以达到470mg/L；当添加浓度为4mM的脯氨酸时，同等水平摇瓶发酵，HYP的产量可以达到6.72g/L。脯氨酸的含量是大肠杆菌中限制HYP生物合成的重要因素。

国内的盛花开等将不同来源的proB、proA、proC、P4H基因，通过重叠延伸PCR串联基因并连接pET-28a载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，培养基不添加L-脯氨酸时，摇瓶水平发酵24小时，E.coli BL21/pET-28a-Bamg中HYP的产量达到0.29g/L，添加4mM的L-脯氨酸时，产量可以达到0.74g/L。

现有技术虽然已实现了不外加L-脯氨酸的情况下生产HYP，但其产量最高也只有0.29g/L，无法真正实现工业生产。综上，提供一种可大幅提高HYP产量的微生物发酵法，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株构建及应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，在所述大肠杆菌中引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因；所述大肠杆菌的putA基因、poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因、adhE基因、aceA基因被敲除；对proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑；对proA的5＇UTR序列进行编辑；对proB基因引入I69E突变。

优选的，所述大肠杆菌的aceK基因被敲除。

优选的，所述大肠杆菌的gdhA基因的启动子和5＇UTR序列被编辑。

优选的，所述大肠杆菌的icd基因的启动子和5＇UTR序列被编辑。

相应的，一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)敲除大肠杆菌BL21(DE3)的putA基因，引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因，获得工程菌21-S1；