[发明专利]一种鉴别禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的实时荧光定量PCR-HRM引物及其方法

说明书

本发明涉及一种鉴别禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的实时荧光定量PCR‑HRM引物及其方法，所述引物的核苷酸序列为：上游引物qDPF：5’‑CCTGGCGAATGTACTTRAAC‑3’，下游引物qDPR：5’‑CACCATCCCCAGCAATAC‑3’；本发明所设计的引物特异性强，利用该引物仅禽腺病毒C型与鸭腺病毒3型可见特异性阳性扩增信号，而其他家禽常见病原没有出现阳性扩增信号；本发明仅需上述一组引物，即可同时对禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型进行进行鉴别诊断。本发明建立的方法简单、经济、方便高效、准确率高，可应用于禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的快速区分。

技术领域

本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一种鉴别禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的实时荧光定量PCR-HRM引物及其方法。

背景技术

按照国际病毒分类委员会(ICTV)分类(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)，腺病毒科(Adenoviridae)下设5个属(Genus)：禽腺病毒属(Aviadenovirus)、富AT腺病毒属(Atadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和美洲白鲟腺病毒属(Ichtadenovirus)。腺病毒为双链DNA无囊膜病毒，呈二十面体对称，衣壳由252个壳粒组成，其中240个为六邻体(hexon)，12个则是五邻体基底(penton)，每个五邻体基底结合着1根至2根纤突。不同腺病毒的基因组大小有所差异，一般在26-45kb之间。按照腺病毒DNA复制的起始时间不同，其基因组可以划分为早期转录基因(E)和晚期转录基因(L)。早期转录基因包含有El(E1A和E1B)、E2(E2A和E2B)、E3和E4四个区，主要负责调节控制病毒的增殖复制。晚期转录基因包括Ll、L2、L3、L4和L5共五个区，主要功能为负责编码病毒的结构蛋白。

禽腺病毒C型(Fowl aviadenovirus C，FAdV-C)和鸭腺病毒3型(Duck adenovirus3，DAdV-3)都属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)。禽腺病毒C型自2015年以来，在全国大范围流行，多呈急性发病，主要引起鸡包涵体肝炎、心包炎综合征，给养鸡业造成巨大的经济损失。近年来禽腺病毒C型的宿主普扩大，不仅感染鸡，鸭也会感染该病毒，感染鸭剖检病变为心包积液和肝坏死。鸭腺病毒3型也是近年来新发现的鸭源腺病毒，该病毒感染主要引起鸭出现肝脏肿大、出血及坏死，近年来鸭群感染该病毒的现象日益普遍，严重影响养鸭业的健康发展。禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型均能感染鸭，引起肝脏坏死，临床上不好准确区分，目前急需一种快速准确区分禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的分子生物学方法，且国内外还没有仅需一组实时荧光定量PCR引物同时对禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型感染情况进行鉴别诊断的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的实时荧光定量PCR-HRM引物及其方法，该方法能够快速有效区分禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型。

本发明根据禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的DNA polymerase基因特征，设计一组引物，该引物对禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型均可扩增，该引物扩增出的禽腺病毒C型的DNA片段与鸭腺病毒3型的DNA片段存在较大的GC含量差异，实时荧光定量PCR反应结束后的熔解曲线存在峰值(Tm值)差异，根据熔解曲线峰值的差异可直接可对禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型进行准确区分。可达到仅需一组引物，即可特异性的对禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型进行快速区分。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种鉴别禽腺病毒C型和鸭腺病毒3型的实时荧光定量PCR-HRM引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物qDPF：5’-CCTGGCGAATGTACTTRAAC-3’，

下游引物qDPR：5’-CACCATCCCCAGCAATAC-3’。

其中，R＝A/G。