[发明专利]基因缺失型中间气单胞菌

权利要求书

1.一株基因缺失型中间气单胞菌在工业化生产内切葡聚糖酶中的应用，其特征在于，所述基因缺失型中间气单胞菌相较于中间气单胞菌WS，其基因组中缺少katE基因，死亡提前发生，且死亡后细菌仍然能够保持完整的细胞形态；分类命名为中间气单胞菌WSΔkatE（Aeromonas media WSΔkatE），于2019年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO: M2019711。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因缺失型中间气单胞菌由中间气单胞菌WS经过katE基因敲除制备而成，具体制备方法如下：

1）以中间气单胞菌WS的基因组为模板，设计引物扩增获得katE基因的上游同源臂和下游同源臂，两同源臂均带酶切位点；

2）将上游同源臂和下游同源臂一起连接至携带氯霉素抗性基因的自杀性载体pDM4上，转化到大肠杆菌中，在添加氯霉素的培养基上进行培养，获得敲除载体；

3）以中间气单胞菌WS作为受体菌，步骤2）获得的含敲除载体的大肠杆菌为供体菌，利用二亲本接合法将二者混合，在不添加抗生素的培养基中培养，使敲除载体进入受体菌；

4）由于敲除载体上携带氯霉素抗性基因，中间气单胞菌WS基因组上携带氨苄青霉素抗性基因，将步骤3）中得到的菌苔稀释涂布在添加氨苄青霉素及氯霉素的培养基生长，筛选出完成第一次同源交换的菌株；

5）将步骤4）得到的发生第一次同源交换的菌株点种于不添加抗生素的培养基上培养，以利于其进行二次同源交换；

6）将步骤5）得到的单菌落点种于含蔗糖的培养基上培养，筛选出发生二次同源交换的菌株；利用katE基因外围引物进行PCR检测katE基因是否被敲除，选取片段大小正确的菌株在不含抗生素的培养基平板上划线分单菌落；

7）取步骤6）的划线得到的单菌落进行PCR验证其基因敲除情况，测序验证无误后，此时即成功获得katE基因敲除菌株。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠5 g/L和水适量；制备固体培养基时，琼脂粉添加量为15 g/L；需添加氨苄青霉素时，氨苄青霉素添加量为100 μg/mL；需添加氯霉素时，氯霉素添加量为34 μg/mL。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤1）中上游同源臂的正反向扩增引物核苷酸序列如下：

正向引物：SEQ ID NO.1；

反向引物：SEQ ID NO.2。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤1）中下游同源臂的正反向扩增引物核苷酸序列如下：

正向引物：SEQ ID NO.3；

反向引物：SEQ ID NO.4。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤6）所述katE基因外围引物对的核苷酸序列如下：

katE基因外围正向引物：SEQ ID NO.5；

katE基因外围反向引物：SEQ ID NO.6。