[发明专利]一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌及其发酵方法和应用

权利要求书

1.一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌通过将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT的基因通过质粒pET-32a(+)导入大肠杆菌中得到；所述基因工程菌的胞内与胞外均能分泌4GT。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码4GT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种胞内外分泌4-α-糖基转移酶的基因工程菌的制备方法，其特征在于，将来源于嗜热栖热菌HB8的编码4GT基因导入质粒pET-32a(+)中，构建得到pET32a-4GT，然后转入感受态细胞BL21(DE3)中，通过选择培养基挑选得到包含该质粒的基因工程菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

1)扩增SEQ ID NO.1所示的目的基因，连接到质粒pET-32a(+)上，转化至感受态的大肠杆菌DH5α，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获取重组质粒pET32a-4GT；

2)将步骤(1)所述的重组质粒pET32a-4GT通过CaCl₂转化法转化至感受态细胞大肠杆菌细胞BL21(DE3)中，涂布于具有100μg/mL氨苄抗生素的固体培养基上，获得包含该重组质粒pET32a-4GT的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为LB、TB、SOB和SOC；

其中，所述LB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨/胰酪胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，琼脂粉：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min；

其中，所述TB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：2g/L；酵母提取物：24g/L；甘油：4mL/L；KH₂PO₄：2.2g/L：K₂HPO₄：9.4g/L；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；

其中，所述SOB固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min；

其中，所述SOC固体培养基的组成及含量为：胰蛋白胨：20g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：0.5g/mL；KCl：2.5mM；MgCl₂：2.5mM；葡萄糖：20mM；琼脂粉：1g/L-2g/L；调节pH至7.0，115℃高温高压灭菌20min。

6.根据权利要求3-5之任一项方法制备得到的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)。

7.一种利用如权利要求6所述的基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)生产4GT的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

1)菌株的活化：将基因工程菌pET32a-4GT/BL21(DE3)接种至2mL-3mL的种子培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养9h-12h；

2)粗酶液的制备：将步骤1)活化好的种子培养液接种至发酵培养基中，在37℃、200rpm的摇床上培养菌液OD600值为0.4-0.6时，加0.2mM-1.5mM IPTG继续诱导表达9h-12h，停止发酵，离心，弃沉淀，收集上清，获得4-α-糖基转移酶的粗酶液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述种子培养基为LB液体培养基，所述LB液体培养基的组成为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，琼脂粉：1g/L-2g/L；最后用蒸馏水补充体系至1L，调节pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min。