[发明专利]一种大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法

说明书

本发明公开了一种大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法，包括：(1)将待鉴定的大豆种子播种，待出苗后取长出的子叶为样品提取蛋白质；(2)将所提取的蛋白质采用ISDS‑PAGE方法进行电泳，分析鉴定Lox‑1，2，3三个目标条带是否缺失。本发明将播种前从种子取样改为播种出苗后取样，这样种子不受损，降低了种子感染病虫害的几率，能够确保含目标性状的大豆种子能安全出苗，大大降低了含目标基因性状个体的死亡率，含目标性状个体的成活率由传统取样法的50％左右提高到99％以上。本发明鉴定方法不仅极大的提高了含目标基因形状的成活率，还有效节约了时间及人力成本。

技术领域

本发明涉及大豆品种脂氧酶缺失的鉴定方法，尤其涉及采用改良的SDS-PAGE鉴定大豆品种脂氧酶缺失的方法，属于脂氧酶缺失大豆品种的鉴定领域。

背景技术

脂肪氧化酶(lipoxygenase,略：Lox)简称脂氧酶，又称脂氧合酶，包含三个同工酶，即：Lox-1，Lox-2和Lox-3。大豆种子破碎遇氧，种子中所含的亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸，在脂氧酶的作用下，就会被氧化成己烯醛、醇、酮等小分子的物质，是大豆产生豆腥味的主要源泉。

为了培育新大豆品种，选取适宜的父母本进行杂交，收获杂交成功的种子称为F1种子，F1种子种下去，再收获的种子称为F2种子，F2代的每一粒种子都具有不同的特点，用什么筛选方法能从众多的F2种子中筛选到含目标性状的种子，又能确保其安全出苗，繁育后代，是大豆品质改良育种的瓶颈。

脂氧酶Lox-1,2,3缺失性状，是有两个等位基因位点控制的隐性性状，根据孟德尔遗传学原理，在Lox-1,2,3完全缺失性状在F2代出现的几率为1/16，在F2代一旦完全缺失个体，这个性状就是纯合的，所以，培育脂氧酶完全缺失的大豆新品种，在种子量最少的F2代进行逐粒筛选，是最经济合算的最佳筛选时期，否则若等到到种子量多的高世代再筛选，将会如同大海捞针，很难筛选到含脂氧酶完全缺失的目标性状个体。但是由于F2代种子每一粒豆各不相同，传统的分析方法须从每一粒F2种子上切取大约10mg的粉末进行分析鉴定，最终获得脂氧酶完全缺失的目标性状个体，但是，在将目标个体播种扩繁时，由于种子已经受过伤害，播下去的目标种子几乎有50％的种子无法安全出苗。导致辛辛苦苦1年多才获得的本来就极少的目标种子的极大地损失甚至全军覆没，1年多的辛苦付出就白白浪费掉了。

现有的脂氧酶缺失大豆新品种的鉴定方法主要有以下几种方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定法：其作用原理是聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，即根据优不同蛋白亚基分子量大小差异，区分蛋白种类。在种子取样方式上：从远离种脐的位置切取8-10mg粉末，提取蛋白，跑胶、染色、脱色、观察鉴定。该方法的优点是：简单易操作，易掌握。该方法存在的主要缺点是：1.对于分子量接近的蛋白亚基的区分比较困难，脂氧酶缺失鉴定就存在这样的问题，由于脂氧酶由三个同工酶构成，分子量在94-97Kd之间，很接近，鉴定三个同工酶同时缺失时比较容易，当需要鉴定其中一个酶缺失时比较困难，存在误判率高的缺点；2.检测周期长，一个周期下来，至少需要10个小时以上。3.最大缺点：苗前取样检测，伤害种子，无法确保含目标基因种子安全出苗，繁殖后代。