[发明专利]一种用于发酵扩充制备活菌制剂的菌种监控方法

说明书

本发明公开了一种用于发酵扩充制备活菌制剂的菌种监控方法，操作如下：(1)选取芽孢率在70％以上且菌体浓度≥10⁹CFU/mL的菌种；(2)自冷藏取出后，进行温度梯度复苏；(3)在摇瓶的种子液或种子罐扩增发酵繁殖至旺盛生长期的后期时，通过涂片镜捡菌种的形态判断转移的最佳时机(即涂片镜捡观察至菌种的形态2/3以上为单体或短链时)转移；(4)待接种的摇瓶液培养基或发酵种子罐培养基在接种时，温度设在菌体分裂繁殖温度30～37℃范围内。通过本发明方法对地衣芽孢杆菌活菌制剂用于发酵的菌种监控，菌种芽孢形成率高，使活菌制剂稳定性增强，同时使发酵产量提高，弥补原专利的缺陷而取得更好的效果。

技术领域

本发明属于菌种发酵监控技术领域，具体是一种用于发酵扩充制备活菌制剂的菌种监控方法。

背景技术

发明人的发明专利，ZL201010578718.0地衣芽孢杆菌菌粉及微生态制剂的制备方法，该方法中对菌种没有提到按规定检查之外用于发酵的监控，因此，存在着最终发酵得到的菌粉芽孢形成率不稳定，发酵中的同步发酵不够，收率不稳定的缺陷。

为了提高微生态地衣芽孢杆菌活菌制剂的质量稳定性和活菌浓度，用于生产发酵的地衣芽孢杆菌工作菌种，除按照相关规定进行鉴定外，还应该采取必要的监控技术。因此有必要在发酵前对生产菌种作芽孢率和菌浓的检测，为保持同步发酵，而对接种时的菌体形态和保持温度等连续性提出要求，这对提高发酵质量和效益至关重要。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于发酵扩充制备活菌制剂的菌种监控方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于发酵扩充制备活菌制剂的菌种监控方法，操作包括：

(1)选取芽孢率在70％以上且菌体浓度≥10⁹CFU/mL的菌种；

为了确保菌种最终发酵的芽孢形成率，用于发酵的菌种要有较高的芽孢率，这里强调指出，菌种的芽孢率在发酵制备工艺相同培养条件下并先后无其他外加因素(如添加促进芽孢形成的物质)下决定了最终发酵的芽孢形成率；

发酵最终的活菌总数产量(CFU活菌数)、活菌浓度取决于菌种的内因即繁殖能力，体现在发酵菌种单位体积或重量的活菌数即活菌数浓度(CFU/ml或CFU/g)。因此，要求菌种的活菌浓度应有较高的水平，以体现菌种的发酵能力，(在相同培养条件和无外加促进生长的物质)影响最终发酵液的菌体浓度；

(2)自冷藏取出后，进行温度梯度复苏；

用于发酵符合要求的菌种(符合菌种规定要求并符合菌浓和芽孢率要求)，自冷藏取出复苏时，应进行温度梯度复苏，先在适宜温度进行存放，然后在菌体分裂繁殖温度存放。经温度梯度复苏的涂片镜捡观察到芽孢多处于萌发和待萌发状态，菌体则处于粗壮待裂繁殖。菌种的温度梯度复苏有利于菌种进入同步发酵，提高发酵产量；

(3)在摇瓶的种子液或种子罐扩增发酵繁殖至旺盛生长期的后期时转移，利于扩充的同步发酵，以取得发酵最多的菌浓和数量。

(4)待接种的摇瓶液培养基或发酵种子罐培养基在接种时，温度设在菌体分裂繁殖温度30～37℃范围内，保持连续性以利于温度梯度复苏的菌种尽快进入扩大繁殖的生长期。

优选地，所述活菌制剂为地衣芽孢杆菌活菌制剂。

优选地，所述菌种可以选自冻干菌种、斜面菌种、平板菌种或其他保存形式的菌种中的任意一种。

优选地，步骤(2)，所述温度梯度复苏包括两个阶段，先在20～25℃恢复适应存放4～8小时，再在菌体分裂繁殖温度30～37℃范围内存放6～12小时。

优选地，步骤(3)，所述旺盛生长期的后期是指通过涂片镜捡观察到2/3以上菌种的形态为单体或短链。