[发明专利]基于诱导多能干细胞的治疗级间充质干细胞制备方法及应用

权利要求书

1.一种iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）iPSCs的培养；

2）消化iPSCs，将消化下来的iPSCs细胞进行悬浮培养，形成拟胚体；

3）拟胚体继续悬浮培养过程中添加诱导培养基组合A诱导分化；

4）拟胚体分化后采用直接贴壁培养或消化后贴壁培养或消化后分选培养获取MSCs。

2.根据权利要求1 所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤1）iPSCs的培养步骤为：采用无异种动物源成分的TeSR™-E8™或者mTeSR1人ESC/iPSC培养基，以无饲养层细胞的培养方式培养iPSCs，培养条件为37℃，5%-10%O₂及10%-15%CO₂，每天换液。

3.根据权利要求2所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤2）消化iPSCs步骤为：iPSCs消化时，培养皿中加入EDTA或Versene Solution，37℃孵育1-10 min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有TeSR™-E8™或者mTeSR1人ESC/iPSC培养基的超低吸附培养皿、细胞培养瓶或细胞培养袋中进行悬浮培养，形成拟胚体。

4.根据权利要求1 所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中的诱导培养基组合A包括：TeSR™-E8™人ESC/iPSC培养基、DMEM高糖培养基、mTeSR1人ESC/iPSC培养基、DMEM低糖培养基、DMEM/F12培养基或任何适合间充质干细胞增殖的培养基中的一种；和CHIR-99021 (CT99021)、CHIR-99021 (CT99021) HCl、AR-A014418、CHIR-98014、TWS119、1-Azakenpaullone、IWP-2中的任何一种或多种成分的组合，单种或多种化合物终浓度1-50 μM；和人血清、胎牛血清、小牛血清、马血清、血清替代物中的任意一种或几种，单种或多种血清终浓度范围1-20%。

5.根据权利要求4所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤3）诱导培养基组合A还包括脂肪酸混合物、1×非必需氨基酸溶液、人成纤维细胞生长因子、维生素C中的一种或几种。

6.根据权利要求1 所述的iPSCs来源的MSCs的制备方法，其特征在于，所述步骤4）的直接贴壁培养方法为：收集步骤3）经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，贴壁培养，待足够的梭形细胞从贴壁拟胚体中爬出后，消化后即可获得MSCs种子细胞；所述消化后贴壁培养方法为：收集步骤3）经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，消化成单细胞悬液后，用间充质干细胞培养基重悬，接种到细胞培养板或培养皿，培养2-8h，换液去除悬浮细胞，贴壁培养达到一定密度后，消化后即可获得MSCs种子细胞；所述消化后分选培养方法为：收集步骤3）经培养基组合A诱导后的拟胚体，离心，并用PBS洗，消化成单细胞悬液后，采用CD73、CD90或其他间充质干细胞表面marker的一种或几种磁珠或流式分选细胞，经悬浮培养或贴壁培养扩增1-3天即获得MSCs种子细胞。

7.权利要求1~6任一项所述的制备方法制备得到的iPSCs来源的MSCs。

8.权利要求7所述的iPSCs来源的MSCs在制备脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞中的应用。

9.权利要求7所述的iPSCs来源的MSCs在制备预防或治疗急性肺损伤药物或抗衰老保健品或药物方面的应用。

10.权利要求7所述的iPSCs来源的MSCs在制备预防或治疗预防或治疗免疫相关疾病方面的应用。