[发明专利]一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法

说明书

本发明涉及循环肿瘤细胞鉴定技术，尤其涉及一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，属生物工程技术领域。本发明采用的是利用免疫微球特异性识别白细胞，排除白细胞的干扰，从而负向鉴定出靶标细胞(循环肿瘤细胞)。克服了部分循环肿瘤细胞因其表面特征抗原EpCAM或CK低表达而无法实现有效正向鉴定的缺点，使靶标细胞(循环肿瘤细胞)的检出率更高。该方法利用抗原抗体特异性反应，直接在明场显微镜下观察细胞表面免疫微球的结合情况，此方法可避免传统的循环肿瘤细胞荧光检测方法必须依赖荧光显微镜、检测成本高、染色流程长、信号易淬灭等问题。且操作费用低、装置易实现，为普通明场显微镜的实验室开展循环肿瘤细胞检测提供了可能。

技术领域

本发明涉及循环肿瘤细胞鉴定技术，尤其涉及一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，属生物工程技术领域。

背景技术

循环肿瘤细胞是由肿瘤原发灶或转移灶脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞。受环境污染、有毒食品和人口老龄化等因素影响，我国正成为癌症的高发区，恶性肿瘤致死正逐渐占据我国成人死因的第一位，我国居民中每年因癌症死亡病例达270万例。恶性肿瘤致命的主要原因是肿瘤细胞获得侵袭能力并由原发灶或转移灶脱落，进入人体血液循环进而侵袭其他脏器实现远端转移。而在外周血中检测脱落的肿瘤细胞是预示肿瘤早期发生和转移最直接和有效的手段，在肿瘤早期临床诊断中具有积极而重要的意义。因此，通过对外周血中循环肿瘤细胞进行捕获和鉴定，可以为癌症的早期诊断和筛查、个体化施药方案的制定、临床放/化疗疗效评价、癌症预后判断以及复发转移检测等提供强大而有力的方法和手段。

循环肿瘤细胞的检测与鉴定首先需要对血液样本中的靶细胞进行富集与分离以提高其检出率，增加检测的灵敏性。但人体外周血中循环肿瘤细胞的数量非常稀少(每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞)，而循环肿瘤细胞分选富集和鉴定将直接影响其后续的检测结果，如循环肿瘤细胞计数、PCR、单细胞测序等。因此，高纯度、高灵敏、快速的循环肿瘤细胞富集鉴定是临床应用中的重点和难点。目前常用的循环肿瘤细胞鉴定方法包括：中国专利公开号：CN105807057A，公开日：2016.07.27，发明名称为：一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法。该文献采用荧光纳米球同时识别循环肿瘤细胞和白细胞能够实现对循环肿瘤细胞的捕获和标记。但仍存在一些问题，例如由于循环肿瘤细胞表面抗原(如EpCAM或CK等)表达的异质性，使用该技术无法检出靶标抗原弱表达的循环肿瘤细胞；中国专利公开号CN105807057A，公开日：2016.06.22，发明名称为：一种外周血循环肿瘤细胞分离鉴定方法。该文献使用膜过滤装置和免疫荧光技术鉴定循环肿瘤细胞，能捕获上皮抗原表达减弱或缺失的肿瘤细胞，但仍存在一些问题，例如使用荧光显微镜，具有信号弱、易淬灭、非特异性吸附干扰等缺点；且鉴定技术操作复杂，鉴定设备昂贵等。

免疫荧光检测技术是最常见的循环肿瘤细胞检测及鉴定技术，可利用荧光显微镜对循环肿瘤细胞进行识别和计数。但该检测技术需要依赖荧光显微镜，具有信号弱、易淬灭、非特异性吸附干扰等缺点；由于循环肿瘤细胞表面抗原(如EpCAM或CK等)表达的异质性，使用该技术无法检出靶标抗原弱表达的循环肿瘤细胞；除此之外，高昂的设备造价和检测费用也限制了其在基础研究和临床检测领域的普及应用。而传统的明场染色方法(如瑞斯-吉姆萨染色)正向鉴定技术非常依赖于人为主观判断，对判读人员的专业经验要求非常高，判读结果存在较大的差异性，检测灵敏度低。因此，基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定技术能够结合免疫识别和明场观测的优势，有效地提高循环肿瘤细胞的检出率和准确度，也突破了原有鉴定技术操作复杂、鉴定设备昂贵的局限，极大地提高了其实际的临床应用。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，该技术能增加循环肿瘤细胞检测的敏感性和特异性，提高循环肿瘤细胞检出率，操作方便快捷，设备造价低廉。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于免疫微球的循环肿瘤细胞明场负向鉴定方法，所述鉴定方法按以下步骤进行：