[发明专利]一种高通量单细胞小RNA文库构建方法

说明书

本发明提供了高通量单细胞小RNA文库构建方法。该方法为：制备单细胞悬液，将其加入到单细胞操作系统的芯片的微孔中，并选择单一活细胞的微孔进行实验；依次进行细胞裂解反应、3’端连接反应、去除游离接头反应、5’端连接反应、反转录反应和两次PCR反应；产物进行纯化和片段筛选回收，从而获得能够直接用于上机测序的单细胞小RNA文库；在进行3’端连接反应过程中，所采用的3’接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；在进行5’端连接反应过程中，所采用的5’接头的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的方法具有准确度高、灵敏度高、重复性好等优点。

技术领域

本发明属于单细胞小RNA测序技术领域，涉及一种高通量单细胞小RNA文库构建方法。

背景技术

miRNA是一种广泛存在于真核生物中，可调节其他基因的表达的非编码RNA。miRNA与一种或多种mRNA分子部分互补，以各种方式下调基因表达，包括翻译抑制，mRNA剪切和脱腺苷化，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。miRNA在癌症等相关疾病形成过程中也起着关键的作用，已经被用于癌症的诊断、分期、进展、预后以及评估治疗的反应性等方面。

现有技术中，Illumina公司和NEB等生物公司采用小RNA标准建库试剂盒。其样本要求起始量高，最低100ng total RNA，无法做到单细胞(10pg/cell)水平；没有设计barcode，无法将多个样品混合建库；没有设计UMI，无法降低由PCR引入的偏好性；接头自连产物与非特异性产物多，导致目的片段连接和扩增困难，建库效率低；PAGE胶回收实验操作繁琐，危险性高。Faridani等人发表于2016年Nature biotechnology杂志和2018年natureprotocol杂志中关于单个细胞small RNA建库过程，该方案由于接头残留过多，并且在实验过程中没有进行目的片段筛选和回收，导致产物中接头自连产量极高，目的产物含量不到1％，测序需要的数据量大大增加，造成了极大的浪费；该方案无单细胞分子标签，使得实验无法提高通量，不能进行多个细胞同时操作；该方案对于3’接头和5’接头没有末端加入随机序列的改进，使得在连接反应过程中，连接反应可能产生偏好性。

因此，目前尚未发展出可在高度异质性的肿瘤样本中，分析单细胞的miRNA表达谱的可行性方法。肿瘤样本通常包含正常细胞和癌细胞，癌细胞中miRNA的表达谱常会被数据分析所掩盖。因此，需要一种高灵敏度、高通量的单细胞小RNA测序文库构建方法。

发明内容

基于现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种高通量单细胞小RNA文库构建方法。本发明的目的还在于提供通过该方法构建获得的单细胞小RNA文库。本发明的方法具有准确度高、灵敏度高、重复性好等优点。

本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

一方面，本发明提供一种高通量单细胞小RNA文库构建方法，其包括以下步骤：

制备单细胞悬浮液，将其加入到单细胞操作系统的芯片的微孔中，并选择单一活细胞的微孔进行实验；

依次进行细胞裂解反应、3’端连接反应、去除游离接头反应、5’端连接反应、反转录反应和两次PCR反应；

产物进行纯化和片段筛选回收，从而获得能够直接用于上机测序的单细胞小RNA文库；

在进行3’端连接反应过程中，所采用的3’接头(RA3-A2N)的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；

在进行5’端连接反应过程中，所采用的5’接头(SR5F)的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明利用单细胞操作系统及上述设计的平行单细胞小RNA测序(PSCSR-seq)流程，通过修饰改良3’接头和5’接头，其中，3’接头的核苷酸序列如下：