[发明专利]胞内劳森菌的培养方法及应用

权利要求书

1.一种胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：贴壁培养猪肠道细胞；

步骤2：待所述猪肠道细胞贴壁培养6～8h，将胞内劳森菌与细胞培养液按体积比0.01～1:1接种至细胞中，置于改良的微需氧环境中培养1～96h；

步骤3：胰酶消化感染步骤2中培养的细胞后，收集感染细胞，并用细胞冻存液重悬感染细胞，转入液氮罐中保存。

2.如权利要求1所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，所述猪肠道细胞为猪空肠上皮细胞IPEC-J2、猪小肠上皮细胞ZYM-DIEC02或猪小肠上皮细胞IPEC-1。

3.如权利要求1所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，步骤1中贴壁培养细胞，具体包括以下步骤：

S1：从液氮罐取出细胞，迅速在37℃水浴锅中摇晃，并在1min之内完全融化；

S2：将融化的细胞加入DMEM完全培养基中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养；所述细胞在完全培养基中的浓度为0.5×10⁶/mL～2×10⁸/mL；

S3：待细胞贴壁生长后，用PBS缓慢清洗细胞2～3次，待细胞汇合度达到80％～90％时，用胰酶消化细胞，将细胞悬液混匀并平铺于24孔板中，每孔中细胞悬液和DMEM完全培养基按体积比1:9加入，混匀后于培养箱中培养。

4.如权利要求3所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，S3中细胞悬液的浓度为0.5×10⁶/mL～2×10⁸/mL。

5.如权利要求1所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，步骤2中所述胞内劳森菌浓度为10^4.9TCID₅₀/ml。

6.如权利要求1所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，步骤2中所述改良的微需氧培养环境是由以下步骤构建：

将N₂、CO₂和O₂按体积比为80～95:5～10:0～10注入储气罐后，再连接至微需氧培养箱，使培养箱中的气体环境为试验所需的微需氧环境。

7.如权利要求6所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，所述N₂、CO₂和O₂体积比为80～87:8～10:5～10。

8.如权利要求1所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，步骤2中所述胞内劳森菌与细胞培养液按体积比0.1～0.3:1接种至细胞中。

9.如权利要求1所述的胞内劳森菌的培养方法，其特征在于，步骤2中在微需氧环境中培养1～12h。

10.由权利要求1-9任一项所述的培养方法培养的胞内劳森菌的应用，其特征在于，应用于胞内劳森菌分离培养和病原性特征的研究中。