[发明专利]一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法

权利要求书

1.一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于：按照以下步骤进行制备：

S1：制取上清液：人脐带间质样本收集于第一离心管中，在1～9℃、250～600g离心10～15分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在3～8℃、9000～11000g离心10～15分钟，分离得到上清液；

S2：连续离心：将步骤S1中取得的上清液，总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，在无血清且去除外泌体的培养液中于37℃培养箱孵育48h后，上清液经400g，第一次离心1～10分钟、3000g第二次离心10～20分钟，10000g第三次离心10～20分钟，在所述第三离心管的底部得到固相物质，移除上层清液后为人脐带间质干细胞总外泌体；

S3：将步骤S1中取得的人脐带间质干细胞总外泌体用60000g的SW28转子浓缩90～120分钟，外泌体沉淀在0.32M蔗糖中重悬，然后100000g离心1-3个小时，留做备用；

S4：用免疫磁珠法，取得重悬液留作备用；

S5：将步骤S4中取得的重悬液，加入第四离心管中，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在第四离心管中得到磁珠结合的外泌体；

S6：向第四离心管中加入pH值为7～8的磷酸缓冲液，然后将第四离心管置于磁力架吸附3～8分钟，再移除管内液体，从而对磁珠结合的外泌体进行清洗；

S7：利用柱平衡液处理羟基磷灰石纯化柱，使纯化柱上各基团处于活化状态，将步骤S6处理后的外泌体样本加入至上述活化的羟基磷灰石纯化柱进行分离纯化外泌体；

S8：利用洗涤液洗涤羟基磷灰石纯化柱，再用洗脱液分别洗脱样品中的外泌体，取得经洗涤后纯化柱；

S9：所述经洗涤后纯化柱用含50～200mM NaPO，0.1～10mM EDTA，pH为6.5-7.5的洗脱液孵育1～5min，4℃，2000～5000rpm离心1-5min，所得洗脱组分为高纯度外泌体，并进行保存。

2.根据权利要求1所述的一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于：所述柱平衡液为50～500mM NaPO，0.1～10mM EDTA，pH为6.0～7.0。

3.根据权利要求1所述的一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于：所述洗涤液为1～15mM NaPO，0.1～15mM EDTA；100mM～1M NaCl，pH为6.0～7.0。

4.根据权利要求1所述的一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于：所述免疫磁珠法指准备25μL预涂有免疫球蛋白G的免疫磁珠与30μL抗CD9单克隆抗体孵育1～2个小时，其后，免疫磁珠与20μg外泌体在4℃混悬1～2个小时，清洗4次后，外泌体和磁珠在PBS中再次重悬。

5.根据权利要求1所述的一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于：所述洗脱液为200-500mMNaPO，0.1-10mM EDTA，pH为6.5-7.5。

6.根据权利要求1所述的一种人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于：将步骤S9中取得的高纯度外泌体20μL与纳米多肽凝胶溶液混合均匀，中静置5min，使其凝固，在-4℃进行保存。