[发明专利]基于非天然氨基酸的基因组重排调控系统和方法

说明书

一种基于非天然氨基酸的基因组重排调控系统和方法，该系统包括：用于非天然氨基酸编码的工具配对，其包括非天然氨酰‑tRNA合成酶及tRNA，该tRNA的反密码子与Cre重组酶编码基因读码框中终止密码子配对，在非天然氨基酸存在和非天然氨酰‑tRNA合成酶的作用下，将终止密码子翻译为非天然氨基酸；用于控制Cre重组酶表达的调控工具，其包括Cre重组酶编码基因，其读码框中包含终止密码子，用于指定非天然氨基酸的插入位点，在该终止密码子读通时产生全长的功能性Cre重组酶，能够作用于重组位点LoxP，进而引发基因组重排，在该终止密码子不能读通时产生截短的失活Cre重组酶。本发明能够安全、高效、精确地调节SCRaMbLE过程的发生，在代谢工程、合成基因组等相关合成生物学领域中具有重要应用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于非天然氨基酸的基因组重排调控系统和方法。

背景技术

合成基因组是合成生物学最重要的研究内容之一，为理解生命活动的本质以及创造出有利于人类需求的生物提供了新的视角和途径。合成酵母基因组Sc2.0计划是合成基因组领域的标杆性项目，旨在合成酿酒酵母所有的染色体，并将其应用于科研和应用中的多个方面。合成型染色体重排调控技术(SCRaMbLE，Synthetic Chromosome Recombinationand Modification by LoxP-mediated Evolution)是合成酵母基因组设计中的一个核心元素，该技术能诱导合成型菌株产生基因组多样性和表型广泛性，其作用机理是通过重组位点LoxP指引，在Cre重组酶的作用下使得基因组发生缺失、倒置、重复等多种类型的结构变异。在上述变异的基础之上，利用SCRaMbLE技术能通过连续地诱导使得基因组变异累计，从而获得更为复杂的基因型多样性。最近的研究成果表明，SCRaMbLE发生后的部分酵母菌株可以提高小分子和蛋白质的异源表达产量，因此具有潜在的重大实际应用价值。

精确控制SCRaMbLE过程是产生和维持具有特定优势的基因型菌株的关键。前期的研究表明，将雌激素结合域EBD与Cre重组酶融合可使其活性受配体依赖控制。因此，Cre-EBD融合蛋白已被广泛应用于执行哺乳动物细胞和酵母中的配体依赖性的重组反应。具体而言，在传统的重组技术中，采用表达pSCW11-Cre-EBD质粒来激活SCRaMbLE的发生。pSCW11启动子是一种子细胞特异性启动子，在每个子代细胞的生命周期中精确地产生一次表达重组酶的脉冲。Cre重组酶的功能受到雌二醇结合域(EBD)的转录后调节，在不存在雌二醇的情况下，松散状态的EBD将融合蛋白(Cre-EBD)隔离在细胞质中。在添加雌二醇的情况下，Cre重组酶被转运到细胞核中作用于重组位点LoxP。然而，上述方法中的Cre重组酶具有功能泄露的问题，即在没有雌二醇诱导的情况下，也能观察到含有该质粒的合成酵母中产生生长缺陷，这导致合成染色体的稳定性降低。

针对传统的重组技术的缺陷，目前已开发出两种升级版的技术，对传统的SCRaMbLE系统进行改造，使功能泄露情况得到一定程度的缓解。

一种是半乳糖操纵的Cre-EBD系统。这种方法采用来pGAL1启动子来调节Cre-EBD融合蛋白的表达，从而调控SCRaMbLE的发生。pGAL1启动子是一种半乳糖诱导的启动子，在半乳糖或者半乳糖类似物存在的情况下启动启动子下游基因的表达，在葡萄糖存在的情况下抑制下游基因的表达。Cre-EBD是Cre重组酶和EBD的融合蛋白，需要雌二醇的存在才能使融合蛋白进入细胞核发挥其功能。因此，半乳糖操纵的Cre-EBD系统是一种对转录和细胞定位水平进行双重调节的方法，需要同时添加半乳糖和雌二醇才能使SCRaMbLE发生。