[发明专利]一种无乳链球菌的检测试剂盒、检测方法

权利要求书

1.一种无乳链球菌的检测试剂盒，该试剂盒包括用于稀释奶液样品的无菌生理盐水、用于菌体裂解的裂解缓冲液，其特征在于，该试剂盒还包括：用于将溶液中残余的乳蛋白和脂类物质溶解在溶液中的洗涤液，用于吸附在分散的二氧化硅的载体上的核酸脱离在溶液中的洗脱液，以及，吸附体系；其中，所述吸附体系为重悬有包埋性单分散二氧化硅磁性微球的裂解缓冲液。

2.如权利要求1所述的无乳链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括浓度均为25％的纯乙醇和异丙醇、浓度为100mmol/L的NaCl、浓度为10mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl；

所述洗脱液包括浓度为10mmol/L的Tris-HCl、浓度为1mmol/L的EDTA。

3.如权利要求1所述的无乳链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述裂解缓冲液中的guanidine thiocyanate浓度为3mol/L、EDTA的浓度为20mmol/L、Tris-HCl的pH为6.8、浓度为10mmol/L、Triton X100浓度为40mg/mL、DL-dithiothreitol的浓度为10mg/mL。

4.如权利要求1所述的无乳链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述无菌生理盐水中氯化钠的浓度为0.9％wt。

5.一种无乳链球菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)通过上述权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒提取含有待检生物材料的核酸；

(2)通过PCR检测反应体系对上述核酸进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳观察。

6.如权利要求5所述的无乳链球菌的检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述提取包括以下步骤：

A、往牛奶离心后所得的沉淀中加入裂解缓冲液和吸附体系，重悬、静置、离心、弃上清；

B、加入裂解缓冲液混匀、离心、弃上清，重复该操作一次；

C、加入洗涤液混匀、离心、弃上清，重复该过程一次；

D、加入100％乙醇溶液混匀、离心、弃上清，在温箱中干燥管底沉淀10min；

E、加入洗脱液，重悬沉淀，在65℃水浴加热，离心，取上清。

7.如权利要求6所述的无乳链球菌的检测方法，其特征在于，在步骤A中，所述牛奶用无菌生理盐水将牛奶样品稀释、离心、弃上清，重复该过程一次。

8.如权利要求5所述的无乳链球菌的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述PCR检测反应体系中无乳链球菌上下游引物为：

无乳链球菌上游引物F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

无乳链球菌下游引物R：5-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3’。

9.如权利要求8所述的无乳链球菌的检测方法，其特征在于，所述PCR检测反应体系是25μL反应体系：Green Taq Mix 12.5μL，dd H₂O 8.5μL，无乳链球菌上下游引物各1μL，待检测菌液2μL；

该PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。