[发明专利]糖尿病疾病模型犬的建立方法

权利要求书

1.用于建立GCK基因点突变糖尿病疾病模型犬的方法，所述方法包括如下步骤：（1）根据犬的GCK基因序列，针对外显子2序列确定打靶位点；（2）根据步骤（1）确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；（3）将sgRNA打靶载体体外转录获得sgRNA的RNA，将BE3体外转录为mRNA；（4）将步骤（3）获得的sgRNA的RNA以及BE3的mRNA混合后胞质内注射到犬的受精卵中；以及（5）将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬一侧输卵管内，从而制备GCK基因点突变糖尿病模型犬，

其中，根据GCK基因序列外显子2设计打靶位点，所述打靶位点序列为：5’-GGATGCAGAGGGAGATGGCG-3’（SEQ ID NO：1），以及

根据所述打靶位点序列合成的sgRNA序列及其互补序列为：

F：CACCGggatgcagagggagatggcg（SEQ ID NO: 8)；和

R：AAACcgccatctccctctgcatccC（SEQ ID NO:9）。

2.根据权利要求1的方法，所述步骤（5）中将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬出血较少的一侧输卵管内。

3.用于建立GCK基因点突变糖尿病疾病模型犬的方法，所述方法包括如下步骤：（1）根据犬的GCK基因序列，针对外显子2序列确定打靶位点；（2）根据步骤（1）确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；（3）将sgRNA打靶载体体外转录获得sgRNA的RNA，将BE3体外转录为mRNA；（4）将步骤（3）获得的sgRNA的RNA和BE3的mRNA混合后胞质内注射到犬体细胞中，然后将犬体细胞核移植到犬去核卵母细胞中；以及在步骤（5）中将犬去核卵母细胞移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备GCK基因点突变糖尿病疾病模型犬，

其中，所述sgRNA序列及其互补序列为：

F：CACCGggatgcagagggagatggcg（SEQ ID NO: 8)，和

R：AAACcgccatctccctctgcatccC（SEQ ID NO:9）。

4.由权利要求1-3任一项的方法获得的GCK基因点突变糖尿病疾病模型犬的体细胞、组织和器官。

5.根据权利要求4的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ ID NO: 2所示的如下序列：

5’-GGATGTAGAGGGAGATGGCG-3’（SEQ ID NO: 2）。

6.根据权利要求4的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ ID NO: 3所示的如下序列：

GCAGAGCAGATCCTGGCGGACTTCCAGATGCAGGAGGCGGACTTGAAGAAGGTGA

TGCGGCGGATGTAGAGGGAGATGGCGCGGGGCCTGCGGCTGGAGACCCACGAGG

AGGCCAGCGTGAAGATGCTGCCCACCTACGTGCGCTCCACCCCAGAAGGCTCAG（SEQ ID NO: 3）。