[发明专利]基因目标区域富集方法及试剂盒

权利要求书

1.一种不以疾病诊断为目的的基因目标区域富集方法，包括：

(1)捕获延伸

通过特异性探针捕获延伸包括目标区域的片段化DNA，以提供捕获延伸产物，所述的特异性探针包括与所述片段化DNA的目标区域互补的序列和通用序列，所述特异性探针的3’末端核苷酸被修饰，用于阻止所述特异性探针的3’末端发生连接反应；

所述步骤(1)的体系中包括特异性探针、DNA聚合酶、dNTP和包括目标区域的片段化DNA；

其中，当所述DNA聚合酶具有3’-5’外切酶活性时单独使用；当所述DNA聚合酶不具有3’-5’外切酶活性时，其需要与用于切除结合目标区域后所述特异性探针的3’末端修饰基团的核酸酶联用；

所述特异性探针的3’末端核苷酸的3位羟基被取代；

所述特异性探针的3’末端的取代基团选自C3Spacer基团；

所述dNTP包含生物素标记的dNTP；

(2)单链连接

使用单链连接酶将步骤(1)所提供的捕获延伸产物的3’端连接接头DNA的5’端，以提供连接产物；

所述接头DNA的5’末端核苷酸被修饰、且在步骤(2)的反应温度下为单链结构；

(3)文库构建

对步骤(2)所提供的连接产物，使用通用引物对进行PCR完成文库构建。

2.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述片段化DNA包含双链DNA和单链DNA，所述片段化DNA的长度为25～200bp。

3.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法，其特征在于，所述特异性探针3’端尾部区域包含错配碱基。

4.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法，其特征在于，所述步骤(2)的单链连接酶为T4RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶；

和/或，接头DNA的5’末端核苷酸被磷酸基团或腺苷基团取代；

和/或，所述接头DNA为5’端区域具有黏性末端的部分双链结构；

和/或，所述接头DNA包括能够被测序系统识别的通用序列、样本标签序列、分子标签序列中的一种或多种的组合。

5.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法，其特征在于，所述步骤(1)中，还包括纯化捕获延伸产物，捕获延伸产物的纯化方法选自磁珠纯化；

和/或，所述步骤(2)中，还包括纯化连接产物或热处理连接产物，连接产物的纯化方法选自硅胶柱纯化。

6.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法，其特征在于，步骤(3)的PCR扩增引物具有与所述特异性探针的通用序列和/或所述接头DNA的通用序列相配合。

7.如权利要求6所述的基因目标区域富集方法，其特征在于，还包括：

(4)对扩增后的连接产物进行测序，以提供目标区域的测序结果。

8.如权利要求1所述的基因目标区域富集方法，还包括：

(5)用检测引物1、检测引物2和探针3检测步骤(3)提供的文库扩增产物，其特征在于，所述检测引物1、检测引物2和探针3中，至少其一包含基因特异性序列；

和/或，所述检测引物2和/或探针3也包含基因特异性序列。

9.一种用于富集片段化DNA目标区域的试剂盒，包括适用于如权利要求1～8任一权利要求所述的基因目标区域富集方法的特异性探针和接头DNA。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下的一种或多种：RNA连接酶，偶联标记分子的dNTP，DNA聚合酶，核酸酶；

和/或，还包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物具有与所述特异性探针的通用序列和所述接头DNA的通用序列中至少部分互补的序列。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，

还包括检测引物1、检测引物2和探针3，三者中至少其一含有基因特异性序列。