[发明专利]一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法

说明书

本发明提供了一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其不仅操作简便，而且筛选效率高。一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将含有质粒的菌株进行传代培养；（2）将传代后的菌悬液在固体平板培养基上划线，培养至长出单菌落；（3）将含筛选压力培养基和不含筛选压力培养基分别分装至多孔板中；（4）挑取单菌落并接种至含有含筛选压力培养基的多孔板的培养孔中，同时挑取同一单菌落并接种至含有不含筛选压力培养基的多孔板的相对应位置的培养孔；（5）培养结束后，在含筛选压力培养基中无法生长而在不含筛选压力培养基中可以生长的菌株即为质粒丢失菌株；筛选压力为抗生素压力、营养缺陷型压力或温度压力。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及菌株筛选，具体涉及一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法。

背景技术

质粒是进行基因编辑的常用载体，广泛应用于基因重组、外源蛋白表达、基因插入和敲除等分子操作中。在一些情况下，质粒发挥功能后需要被人为地消除，以避免其带来的其他性状的改变。现有的可丢失质粒如温度敏感型、紫外线敏感型质粒等，由于需要使用特定的质粒，因此在进行基因编辑时存在一定的应用局限性。通过传代进行质粒丢失的方法适用于绝大多数质粒，但存在后续筛选工作量大的缺点。同时，传代进行质粒丢失的方法基于三角摇瓶进行筛选，筛选通量小且人力操作强调大，难以对大量的待筛菌株进行有效地筛选。

发明内容

本发明提供了一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其不仅操作简便，而且筛选效率高。

其技术方案是这样的，一种质粒丢失菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将含有质粒的菌株进行传代培养；

（2）将传代后的菌悬液在固体平板培养基上划线，培养至长出单菌落；

（3）将含筛选压力培养基和不含筛选压力培养基分别分装至多孔板中；

（4）挑取单菌落并接种至含有含筛选压力培养基的多孔板的培养孔中，同时挑取同一单菌落并接种至含有不含筛选压力培养基的多孔板的相对应位置的培养孔中；

（5）培养结束后，在含筛选压力培养基中无法生长而在不含筛选压力培养基中可以生长的菌株即为质粒丢失菌株；

所述筛选压力为抗生素压力、营养缺陷型压力或温度压力。

进一步的，所述含有质粒的菌株为人工导入质粒后的改造菌株，或者，从自然界分离的含质粒菌株。

进一步的，所述步骤（1）中，采用100 mL三角摇瓶，培养条件为30°C，220 rpm/min，培养12 h为一代。

进一步的，所述步骤（3）和步骤（4）中所述多孔板为48孔板。

进一步的，所述筛选压力为营养缺陷型压力；

不含筛选压力培养基含有无氨基酸酵母氮源13.4 g·L-1，生物素0.4 mg·L-1，葡萄糖20 g·L-1，组氨酸0.04 g·L-1。

含筛选压力培养基含有无氨基酸酵母氮源 13.4 g·L-1，生物素0.4 mg·L-1，葡萄糖20 g·L-1。

本发明的上述高通量筛选方法具有以下有益效果：

（1）传统采用摇瓶培养传代进行质粒丢失菌株筛选时，由于需要采用液体筛选压力的培养基，需要用PBS清洗菌体3次，以避免残存培养基造成的影响，从而增加操作步骤且增加染菌风险，本发明筛选时采用固体培养基，并把单菌落作为种子接入多孔板中，无需清洗菌体，同时可将残余培养基影响降至最低；