[发明专利]酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法

说明书

本发明公开了一种酶促低场核磁共振免疫传感器检测食源性致病菌的方法，主要内容是将Mn(VII)/Mn(II)作为信号读出系统，结合免疫分析技术，构建了基于抗体‑抗原识别的磁免疫传感器，在该方法中，将碱性磷酸酶(ALP)作为免疫标记酶应用到该传感器中，将抗坏血酸磷酸酯作为ALP的底物，ALP可以将抗坏血酸磷酸酯去磷酸化，进而转化为具有还原性的抗坏血酸，而抗坏血酸可以将Mn(VII)转变为Mn(II)，进而引起磁信号(横向弛豫时间，T₂)从无到有的改变，T₂的改变量和待测样品中食源性致病菌呈正相关。本发明拓宽了基于超顺纳米磁颗粒磁弛豫时间传感器检测范围的限制，极大地提高了分析性能，进而为食品安全的前期防控提供一种有力的工具。

技术领域

本发明属于分析化学和食品安全领域，具体而言，本发明涉及一种碱性磷酸酶催化的低场核磁共振免疫传感器检测致病菌的方法。

背景技术

食源性致病菌是导致食品安全问题的一个重要的因素，快速、高灵敏检测食源性致病菌对保障食品安全具有重要意义。目前主要的检测方法有微生物培养法、免疫检测方法和PCR分子诊断方法。微生物培养法需要较长的培养时间，操作步骤繁琐，不适合现场、快速检测。免疫检测方法，主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析试纸条法。酶联免疫吸附法需要多步操作，检测时间较长，同时灵敏度也不能满足样品中痕量的食源性致病菌检测的需要，而胶体金免疫层析试纸条的方法，具有检测速度快，一步操作即可完成的优势，但其灵敏度比酶联免疫吸附法还低，无法实现低浓度的食源性致病菌的检测。PCR分子诊断方法是检测致病菌的金标准，但其需要昂贵的设备和洁净的环境，并且需要多轮的扩增，不适合现场分析。

低场共振免疫传感器是一种将纳米磁颗粒优异的磁学性质和免疫分析高特异性相结合的一种生物传感器。相比其他免疫传感器，低场核磁共振免疫传感器具有两个独特的优势：(1)其是一种均相反应体系，可以避免ELISA方法中多步操作，多步洗涤的步骤；(2)因为食品样品中磁信号背景低，因此将纳米磁颗粒作为磁信号探针，可以避免复杂样品基质的背景信号干扰，具有很高的信噪比，适合浑浊样品的分析，有利于提高方法的准确性。因此低场核磁共振免疫传感器在食品安全、环境监测、体外诊断等领域得到了广泛的应用。但传统的低场核磁共振免疫传感器也存在如下问题：(1)缺乏有效的信号放大系统，灵敏度偏低，特别是检测痕量食源性致病菌，其灵敏度和准确性很难胜任；(2)稳定性比较差: 某些因素会导致磁颗粒的聚集，产生假阳性结果，进而影响了结果的可靠性；(3)制备稳定性好的超顺纳米小磁颗粒的工艺比较复杂，成本也比较高，重复性和稳定性都有待进一步提高，因此需要开发稳定性更好，成本更低，可操作性更好的磁信号探针显得尤为重要。

在免疫分析或者免疫传感分析中，免疫标记酶是最重要的元素之一，是保证方法具有高灵敏度的关键因素。目前，辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)是应用最为广泛的免疫标记酶，具有催化效率高、稳定性好等优势。因此，如果可以将酶的高效催化性能和磁传感信号转换有机结合，将大大提高低场核磁共振免疫传感器的灵敏度和稳定性。要实现上述目标，需要找到相应的底物，并且这个底物被该酶催化之后的产物可以实现磁信号的转化。