[发明专利]一种提高动物繁殖力的INH-GNIH双表达基因疫苗、其制备方法与应用

说明书

本发明提供了含有提高动物繁殖力的INH‑GNIH双表达基因疫苗及其工程菌株，保藏于2018年8月15日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2018541。提供了INH‑GNIH双表达基因疫苗的制备方法，将该工程菌直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物，可有效提高动物的繁殖力。其双表达基因为抑制素、促性腺激素释放抑制激素的双表达非抗性DNA质粒，可以直接免疫动物，通过喷鼻、口服、拌饲等方式，经粘膜免疫产生抗体。由于不含抗性基因，不须引入外源抗生素进行筛选，所以不产生抗生素残留。相对于其它基因疫苗需要质粒提取、纯化，生产成本较高，肌肉注射麻烦，并使动物产生应激反应，该疫苗生产成本低，使用方便，而且无抗性和注射应激反应。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高动物繁殖力的INH-GNIH 双表达基因疫苗、其制备方法与应用。

背景技术

泡发育受多种激素的综合调控，既有促进其发育也有抑制其发育的；如促性腺激素、促性腺激素释放激素为促进卵泡发育的激素，，如卵泡抑制素 (inhibin，INH)和促性腺激素释放抑制激素(Gonadotropin inhibiting hormone, GnIH)等为抑制卵泡发育的激素。

卵泡抑制素(INH)是转化生长因子-β(TGF-β)家族成员，为分子量 31～34kd的异二聚体糖蛋白，其由性腺分泌，通过α亚基(18kd)密切相关的β亚基两个中的一个(βA和βB，大约14kd)组成一种异二聚体糖蛋白激素。亚基α与βA或βB亚基通过二硫键连接，分别形成抑制素A和抑制素B。INH是下丘脑-垂体-性腺轴调控系统中重要的激素之一，通过负反馈调控机体FSH 的合成和分泌，进而调控卵泡发育。INH免疫动物能够促进卵泡发育，且有剂量依赖关系。Han等在2008年研究分别用10、50和100μg的pCIS质粒以20 天的间隔免疫大鼠3次，并用50μg pcDNA3.1和100μl浓度为0.85％的盐水作对照，发现在第2次和第3次免疫后，试验组的平均成熟卵泡数比对照组多3.6 和4.9个(P<0.05)，平均产仔数和胎盘数也显著提高。尤其是高剂量组(100 μg PCIS)的成熟卵泡数，明显高于其他试验组，能显著增加成熟卵泡数，但对卵巢大小和重量无影响。Wang等在2012年研究分别用10、50、100μg/100 μl的pcISI质粒免疫小鼠，并用100μg pcMV-s和100μl生理盐水作对照，发现免疫组小鼠的血浆FSH、雌二醇浓度均高于对照组(P<0.05)，且在高剂量组的效果最好(P<0.05)。与对照组相比，所有免疫组的卵巢重量(P<0.05)、长度和宽度(P>0.05)均有变化，特别是高剂量组的成熟卵泡数高于其他各组 (P<0.05)，产仔数增加。Mao等在2016年研究将120只鸡分为4组，用0、25、 75或125μg的pcISI肌肉注射母鸡，20天后进行加强免疫。结果表明，各免疫组的优势卵泡和大白卵泡数均高于对照组(P<0.05)。特别是高剂量组，小黄卵泡数增加(P<0.05)，产蛋性能显著提高。

GnIH是RF(精氨酸-苯丙氨酸)酰胺肽(RFRP)，其生物学作用主要抑制垂体前叶分泌FSH(促卵泡素)和LH(促黄体素)，与GnRH相反。 GnIH能抑制鸡和鹌鹑脑垂体释放LH和FSH。静脉给予RFRP-3可降低性腺切除雄性大鼠的外周血促性腺激素水平，抑制成年小鼠的睾丸类固醇激素生成和精子发生，绵羊LH的脉冲幅度，抑制LH和FSH分泌。此外，也有研究表明，GnIH抑制鸡的卵泡发育和类固醇生成。以上研究提示，GnIH 可能直接或间接抑制卵泡发育和排卵。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有提高动物繁殖力作用的INH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌。本发明的另一个目的是提供一种非抗性筛选的抗抑制素和促性腺激素释放抑制激素的共表达质粒；该质粒可作为DNA疫苗免疫动物，提高动物的繁殖能力，克服了一些技术难题。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：