[发明专利]一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重PCR检测引物及试剂盒

权利要求书

1.一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重PCR检测引物组，所述检测引物的核苷酸序列如下所示：

ASFV-P72-F：5’AACCAGTGGCCCTCTCCTAT 3’（SEQ ID NO：1）；

ASFV-P72-R：5’AATCGCATTGCCTCCGTAGT 3’（SEQ ID NO：2）；

ASFV-CD2V-F：5’TCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGT 3’（SEQ ID NO：3）；

ASFV-CD2V -R：5’AGATAATGGCGGGATATTGGGTAGT 3’（SEQ ID NO：4）；

ASFV-360-505R-F：5’TCTTGTCCTTTTCATACGCCTCAT 3’（SEQ ID NO：5）；

ASFV-360-505R-R：5’GAGCACACCTGGGACCTCT 3’（SEQ ID NO：6）。

2.一种用于快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂和PCR扩增试剂。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒P72基因的质粒DNA。

6.一种非疾病诊断目的的非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速区分方法，其特征在于，包活以下步骤：

S1.从样品中提取病毒核酸；

S2.以核酸为模板，用权利要求1所述的检测引物组对样品进行PCR扩增反应获得扩增产物；

S3.将PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：

当无扩增产物时，则样品中没有病毒；

当扩增产物为三条片段，分别为1005，414和225bp，则样本中的病毒为野毒株；

当扩增产物为一条片段1005bp，则样本中的病毒缺失CD2V和360-505R基因；

当扩增产物为两条片段1005和414bp，则样本中的病毒缺失CD2V基因；

当扩增产物为两条片段1005和225bp，则样本中的病毒缺失360-505R基因。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的反应体系包括：2×Premix rTaq 10μL，三对引物20μM 的ASFV-P72-F/R、10μM 的ASFV-CD2V-F/R、10μM 的ASFV- 360-505R-F/R各1μL，模板DNA 1μL，补加去离子水至20μL。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述2×Premix rTaq包含TaKaRa Taq酶1.25U/25μL，dNTP Mixture各0.4 mM，Taq Buffer 3 mM Mg²⁺，色素Marker。

10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸70s，共30～35个循环；最后72℃延伸10min。