[发明专利]一种表达eGFP的同源重组载体、重组细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达eGFP的同源重组载体，包括载体骨架和插入片段，其特征在于，所述插入片段包括左同源臂、CMV启动子、eGFP表达框和右同源臂；

所述左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述右同源臂的核苷酸序列如SEQID No.2所示；

所述载体骨架为Pd-N1；所述载体骨架的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述左同源臂、CMV启动子和eGFP表达框的核苷酸序列顺次连接，插入到骨架载体Pd-N1上的EcoR I酶切位点和BamH I酶切位点之间；

所述右同源臂的核苷酸序列插入到骨架载体Pd-N1上的Sal I酶切位点和Not I酶切位点之间。

2.权利要求1所述的同源重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将左同源臂插入骨架载体Pd-N1上的EcoRI酶切位点和HindIII酶切位点之间，得到载体pd-5’arm；

2)将启动eGFP基因的CMV启动子插入到载体pd-5’arm上的HindIII酶切位点和NheI酶切位点之间获得载体pd-5’arm-CMV；

3)将eGFP基因表达框插入到载体pd-5’arm-CMV上的NheI酶切位点和BamHI酶切位点之间获得载体pdEgf-G418-5’arm；

4)将右同源臂插入载体pdEgfP-G418-5’arm上的NotI酶切位点和Sal I酶切位点得到同源重组载体pdEgfP-G418-5’arm-3’arm。

3.一种重组细胞，包括外源基因eGFP表达框和宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为非洲绿猴胚胎肾上皮细胞；

所述的重组细胞的制备方法，包括将权利要求1所述的表达eGFP的同源重组载体与CRISPR/Cas9打靶载体共同转入宿主细胞中，获得定点整合eGFP的非洲绿猴胚胎肾上皮重组细胞；

所述CRISPR/Cas9打靶载体中包括编码sgRNA的基因；所述编码sgRNA的基因由核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的sgRNA退火获得。

4.权利要求3所述的重组细胞在制备疫苗中的应用。