[发明专利]一种筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法

说明书

本发明属于疾病生物标志物筛选技术领域，尤其涉及一种筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法，包括以下步骤：S1，分别从阿尔茨海默病患者和健康对照者获取粪便；S2，分别提取步骤S1获取的粪便的粪菌外膜囊泡，并进行纯化；S3，使用气相色谱‑质谱联用仪分别对步骤S2纯化后的粪菌外膜囊泡的代谢产物进行GC‑MS分析；S4，对步骤S3获得的GC‑MS数据进行分析，筛选出差异代谢产物，即为用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物。本发明对阿尔茨海默病的诊断具有重要意义。

技术领域

本发明属于疾病生物标志物筛选技术领域，尤其涉及一种筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)，最常见的痴呆类型，是一种神经退行性疾病，其病因和发病机制不确定，主要影响老年人。随着全世界人口老龄化，AD的患病率迅速增加，对所有国家来说都将是一个沉重的经济负担。肠道微生物群(Gut microbiota，GM)通过肠道微生物群-脑轴调节神经胶质细胞的活化，参与神经元的突触传递和大脑中脂质的代谢。肠道微生物群异常代谢产生的代谢产物可引起大脑炎症和免疫反应，病理改变可引起临床表现，如精神和行为异常。研究表明GM在AD的发病机制中起着潜在的作用，与健康对照组相比，AD患者的粪便中富含蛋白细菌丰富，而firmicute门的比例显着降低，中枢神经系统免疫和神经内分泌发生变化。此外，Harach等人的另一项研究发现，老年AD小鼠的GM移植到无菌幼鼠体内，发现脑内Aβ斑块显着增加。然而，GM对AD的机制尚不清楚。细菌分泌的外膜囊泡(OMVs)，直径20～250nm，携带细菌脂多糖，蛋白酶，膜受体，DNA，RNA等。Koeppen K等报告称，OMV在通信和监管中起着至关重要的作用。然而，来自AD的GM的OMVs中的代谢物生效是一个关键问题。但目前还没有关于GM中AD和OMVs的研究。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术的不足，而提供一种筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法，通过提取并纯化粪菌外膜囊泡并对其进行多重分析，筛选出阿尔茨海默病患者和健康对照者的粪菌外膜囊泡的差异代谢产物，并将其作为用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物，对阿尔茨海默病的诊断具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法，包括以下步骤：

S1，分别从阿尔茨海默病患者和健康对照者获取粪便；

S2，分别提取步骤S1获取的粪便的粪菌外膜囊泡，并进行纯化；

S3，使用气相色谱-质谱联用仪分别对步骤S2纯化后的粪菌外膜囊泡的代谢产物进行GC-MS分析；

S4，对步骤S3获得的GC-MS数据进行分析，识别出差异代谢产物，即为用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物。

作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，步骤S2的具体操作为：

1)分别将粪便与甘油以9：1的体积混合后储存在-80℃冰箱中；

2)每个样品取30～40g的粪便分别溶解在冰上，并将解冻的粪便加入到4ml的0.9％生理盐水中，得到粪便混合物；

3)将粪便混合物充分搅拌直至均质化，然后过滤2～3次以除去大颗粒，并将滤液分别置于50ml离心管中进行差速离心，以除去肠道菌群中的粪便物质杂质和小片段，最后将最终得到的上清液分别通过孔径为0.45μm和0.22μm的过滤器过滤，得到滤液。

作为本发明所述的筛选用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的方法的一种改进，所述差速离心的具体操作为：先以400×g的转速离心10分钟，重复2次；再以1000×g的转速离心15分钟，重复5次；然后以3000×g的转速离心30分钟；最后以5000×g的转速离心1小时，重复2次；以上所有操作均在4℃下进行，每次离心后仅取上清液进行下一次离心。