[发明专利]一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法

权利要求书

1.一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，其特征在于：ARTP诱变处理后的菌悬液，适当稀释后进行烯草酮平板初筛，于培养箱中避光保存，平板上能够生长出来形态大的菌落视为可能高产的菌株，然后以磷酸香草醛法和摇瓶发酵培养测定的DHA产量进行复筛，最终筛选出高产新菌株。

2.根据权利要求1所述的一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，其特征在于：所述的ARTP诱变处理是将对数时期的裂殖壶菌置于ARTP诱变仪内辐照处理，辐射时间为40s，功率设定为120 W，气量设定为10 SLM。

3.根据权利要求1所述的一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，其特征在于：所述的烯草酮（clethodim）是一种环己烯酮类除草剂，主要作用于乙酰辅酶A羧化酶（ACCase），当烯草酮存在时，可以高效抑制ACCase的活性，使生物脂肪酸合成受阻，导致生物生长缓慢，甚至死亡；在培养基中加入烯草酮后，诱变处理后只有突变体ACCase活性高的裂殖壶菌才能存活下来。

4.根据权利要求1所述的一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，其特征在于：所述烯草酮平板初筛是将野生型裂殖壶菌在液体培养基中培养24-36 h，10倍稀释法稀释1000倍后，分别取一定体积菌液均匀涂布在烯草酮浓度为0、20、40、60、80、100 μg/mL的固体平板上，放入28℃恒温箱中避光培养2-3 d；统计生长出的单菌落个数，计算出不同浓度下烯草酮对裂殖壶菌的致死率，选择致死率在90%-95%之间的浓度进行后续筛选实验。

5.根据权利要求1所述的一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，其特征在于：所述的磷酸香草醛法是用发酵液菌体经18 mol/L H₂SO₄破壁后，与磷酸香草醛反应生成有色物质，通过比较紫外分光光度计下OD₅₃₀值的相对大小来筛选可能高产的菌株。

6.根据权利要求1所述的一种高产DHA裂殖壶菌突变菌株的筛选方法，其特征在于： 所述的摇瓶发酵培养测DHA产量具体为取冻干的菌体加入4%硫酸甲醇溶液2 mL、1.0 g/L的十九烷酸内标溶液100 μL，混合均匀；置于80 ℃恒温水浴锅中1 h，取出冷却至室温，随后分别加入1 mL正己烷和1 mL超纯水，混匀离心取上层有机相，过0.22 μm滤膜后测气相得DHA含量。